擬穴青蟹幾個(gè)免疫相關(guān)重要基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、擬穴青蟹是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖蟹類，具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但在人工養(yǎng)殖過程中容易受細(xì)菌、病毒的感染而導(dǎo)致其繁殖和養(yǎng)殖過程中存活率較低，從而給擬穴青蟹的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。如何通過提高擬穴青蟹自身的免疫力來抵抗日益嚴(yán)重的病害己成為目前蟹類養(yǎng)殖業(yè)中一個(gè)亟待解決的問題。本論文擬從分子生物學(xué)的角度，通過研究擬穴青蟹生長(zhǎng)過程中及細(xì)菌感染下免疫相關(guān)的基因表達(dá)譜變化規(guī)律，探討這些基因在青蟹免疫過程中的作用，為解決病害問題提供必要的理論基礎(chǔ)。
　

2、　 本研究通過構(gòu)建cDNA文庫(kù)，借助cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)和熒光定量PCR技術(shù)對(duì)與擬穴青蟹免疫相關(guān)的基因進(jìn)行克隆和表達(dá)模式分析，利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析和研究，為解決擬穴青蟹的免疫研究提供基礎(chǔ)資料。主要研究結(jié)果總結(jié)如下：
　　 1.生物體中鐵蛋白是一種重要的儲(chǔ)存鐵的蛋白。運(yùn)用克隆測(cè)序和SMART技術(shù)從擬穴青蟹的肝胰腺cDNA文庫(kù)中分離得到了一條cDNA全長(zhǎng)序列，通過Mega軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這條cDNA序列

3、與其他物種鐵蛋白基因之間具有較高的同源性，經(jīng)綜合分析確定為鐵蛋白基因(SpFer)。擬穴青蟹鐵蛋白基因由767bp組成，包含一個(gè)513bp的開放閱讀框，它編碼一個(gè)分子量約為19440道爾頓，等電點(diǎn)為5.24的蛋白。該基因編碼的鐵蛋白與凡納濱對(duì)蝦的鐵蛋白序列有83％相似度。運(yùn)用Quantitativereal-timePCR技術(shù)，研究了鐵蛋白基因在擬穴青蟹的肌肉、心臟、眼柄、肝胰腺、精巢、卵巢等各個(gè)不同組織及從溞狀幼體Z1-Z5、大眼幼體

4、和仔蟹Ⅰ期7個(gè)不同發(fā)育階段的時(shí)空表達(dá)差異，檢測(cè)的各個(gè)組織以及不同的發(fā)育時(shí)期鐵蛋白基因均有表達(dá)，其中心臟和肝胰腺中鐵蛋白基因的表達(dá)量最高，精巢中表達(dá)量最低，在不同發(fā)育時(shí)期溞狀幼體Z1期SpFer表達(dá)量最高，大眼幼體時(shí)期表達(dá)量最低。鐵蛋白通過調(diào)節(jié)生物體內(nèi)鐵的含量，抵抗外界損傷，提高機(jī)體免疫力，因此，本實(shí)驗(yàn)為深入研究擬穴青蟹鐵蛋白基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。
　　 2.C型凝集素是一類能專一識(shí)別糖類化合物，參與生物內(nèi)在免疫反應(yīng)的蛋白。運(yùn)

5、用克隆測(cè)序和SMART技術(shù)從擬穴青蟹幼體的cDNA文庫(kù)中分離得到了兩條C型凝集素(SpLec1和SpLec2)的cDNA全長(zhǎng)序列。SpLec1由756bp組成，編碼165個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量約為18250道爾頓。SpLec2由834bp組成，編碼由186個(gè)氨基酸組成，分子量約為19700道爾頓的蛋白。運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)研究了C型凝集素基因在擬穴青蟹的肝胰腺、精巢、卵巢、肌肉、眼柄、鰓、血淋巴等各個(gè)不同組織，溞狀幼體Z1-Z55個(gè)

6、不同發(fā)育階段的時(shí)空表達(dá)差異。分析結(jié)果表明SpLec在血淋巴、肝胰腺、精巢、肌肉中均有表達(dá)，其中在血淋巴中表達(dá)水平最高。在不同的幼體發(fā)育時(shí)期SpLec均有表達(dá)，其中溞狀幼體Z4期表達(dá)水平最高，Z5期表達(dá)水平最低。用副溶血性弧菌對(duì)大眼幼體處理，發(fā)現(xiàn)開始時(shí)SpLec的表達(dá)量較低，浸泡3h時(shí)表達(dá)量上升至最高點(diǎn)，之后回歸到原來水平。C型凝集素參與大量的先天免疫防御和細(xì)胞連接反應(yīng)，本研究對(duì)了解擬穴青蟹的免疫系統(tǒng)具有重要的參考價(jià)值。
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7、.熱激活蛋白HSP90是一種高度保守的蛋白，具有穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)、參與機(jī)體免疫、細(xì)胞周期調(diào)控的作用，在維持機(jī)體的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。采用RACE-PCR技術(shù)從擬穴青蟹中克隆到熱激活蛋白HSP90基因的cDNA全序列(SpHSP90)。SpHSP90基因cDNA全長(zhǎng)2677bp，包含428bp的3’非編碼區(qū)域(UTR)和83bp5'非編碼區(qū)，開放閱讀框(ORF)為2166bp，預(yù)測(cè)編碼一個(gè)分子量為82710道爾頓，等電點(diǎn)為4.62的蛋白。其N

8、端具有HSP90保守的ATPase結(jié)構(gòu)，C端具有HSP90家族保守的序列MEEVD。與三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)相比較，相似性高達(dá)98％。運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)研究了HSP90基因在擬穴青蟹肝胰腺、精巢、卵巢、肌肉、眼柄、鰓、血淋巴等各個(gè)不同組織中的表達(dá)情況，分析結(jié)果表明除眼柄外，SpHSP90在上述不同組織中均有表達(dá)，其中在心臟和肝胰腺中表達(dá)水平較高。分別用副溶血性弧菌和滅活的副溶血性弧菌注射成體擬穴

9、青蟹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SpHSP90mRNA表達(dá)量在感染副溶血性弧菌后明顯提高，6小時(shí)后達(dá)到最高水平，活菌組的表達(dá)量明顯高于滅活菌組的表達(dá)量(P<0.01)。HSP90可能在擬穴青蟹的免疫和抗菌過程中具有重要作用。
　　 綜上所述，本研究克隆得到了3個(gè)與擬穴青蟹免疫相關(guān)基因的cDNA全長(zhǎng)，運(yùn)用Ouantitativereal-timePCR技術(shù)研究了它們?cè)跀M穴青蟹不同組織以及不同發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)模式，為擬穴青蟹的免疫研究提供必要的理