水蛭源性類胰蛋白酶抑制劑基因的克隆與表達.pdf

1、目的：
　　構建水蛭源性類胰蛋白酶抑制劑(LDTI)原核表達載體,將其轉化入大腸桿菌[BL21(DE3)]中優(yōu)化表達條件,以期獲得重組類胰蛋白酶抑制劑的高效表達,并為進一步研究水蛭源性類胰蛋白酶抑制劑的生化特性,生物學功能及其對于肥大細胞影響和對過敏性疾病的潛在治療作用奠定基礎。
　　方法：
　　1.基因克隆
　?、?LDTI基因擴增:以含目的基因片段的質(zhì)粒為模板,運用PCR技術擴增出LDTI基因,通過瓊脂糖凝膠

2、電泳檢測PCR結果。
　?、?T克隆載體的構建:將上步所得DNA片段與pMD18-T載體連接,構建含目的片段的T載體克隆,轉化入大腸桿菌[JM109],擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒,通過菌落PCR,以及限制性內(nèi)切酶雙酶切和基因測序進行質(zhì)粒鑒定。
　?、?pET28a-LDTI載體的構建:對上述T載體進行雙酶切,取目的片段與經(jīng)過雙酶切的pET28a片段連接,構建原核表達載體pET28a-LDTI重組質(zhì)粒亞克隆,將其轉化入大腸桿菌[JM10

3、9],擴大培養(yǎng),提取質(zhì)粒,進行菌落PCR、限制性內(nèi)切酶雙酶切和基因測序鑒定。
　　2.蛋白表達
　　① pET28a-LDTI表達載體轉化[BL21(DE3)]。
　?、?IPTG誘導pET28a-LDTI基因表達目的蛋白。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳及Western blot方法鑒定蛋白。優(yōu)化誘導表達的時間和IPTG的誘導濃度,誘導重組蛋白快速大量表達。
　　結果：
　　1.瓊脂糖凝膠電泳圖像上

4、在約140bp處可見一條亮帶,表明成功擴增了目的基因片段。
　　2.菌落PCR,雙酶切以及基因測序結果顯示利用基因克隆技術成功構建了T克隆載體。
　　3.菌落PCR,雙酶切以及基因測序結果顯示利用基因克隆技術成功構建了pET28a-LDTI表達載體。
　　4.pET28a-LDTI重組子可被IPTG誘導表達,并且可以高效表達LDTI,在Tricine-SDS-PAGE電泳圖像上約6.8KD處表現(xiàn)為一條粗蛋白帶。符合We