鼠疫耶爾森菌特異性抗原的克隆表達(dá)與初步應(yīng)用研究.pdf

1、目的：利用基因工程的技術(shù)手段，獲得融合表達(dá)的鼠疫菌特異性抗原，建立一種非F1抗原的新型鼠疫快速診斷方法，并與經(jīng)典的鼠疫菌檢測(cè)方法相結(jié)合用于解決鼠疫監(jiān)測(cè)現(xiàn)場(chǎng)工作中遇到的各種問(wèn)題。 方法：選取了四個(gè)鼠疫菌的特異基因(YP01089、pst、ymt、hmsH)，根據(jù)已發(fā)表的鼠疫菌C092株全基因組序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增目的基因片段。實(shí)驗(yàn)中采用pET-30a(+)作為表達(dá)載體，通過(guò)雙酶切反應(yīng)和連接反應(yīng)，將目的基因片段定向插入到載體中，

2、構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。IPTG誘導(dǎo)，使重組質(zhì)粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中穩(wěn)定高效地表達(dá)帶有組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白。Western-blot法鑒定各融合蛋白的免疫反應(yīng)性。應(yīng)用固定化金屬離子親和層析技術(shù)(Ni-NTA柱)純化重組蛋白，并初步建立了基于該重組蛋白的間接ELISA方法。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)獲得了五種融合表達(dá)蛋白-重組YP01089、重組Pst、重組Ymt、重組的去掉信號(hào)肽的HmsH、重組的完整HmsH，除重組Pst以

3、可溶形式存在外，其他四種均形成了包涵體。且Western-blot結(jié)果顯示重組Pst可與鼠疫診斷血清和確診病人血清發(fā)生特異性反應(yīng)。用純化的重組Pst建立的間接ELISA方法，對(duì)86份現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)標(biāo)本及4份浙江省F1抗體高滴度者的血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法可以將人和動(dòng)物的陽(yáng)性與陰性標(biāo)本明顯地區(qū)別開(kāi)來(lái)，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)證明存在于浙江F1抗體高滴度者血清中的抗鼠疫菌素抗體的相對(duì)含量與健康人無(wú)顯著差別。 結(jié)論：基于重組Pst的間接ELI