Gibson Assembly改良分子克隆系統(tǒng)構(gòu)建及應(yīng)用與黑素母細(xì)胞SV40T重編程的研究.pdf

1、本課題研究包含了三個(gè)分子克隆系統(tǒng)改建的技術(shù)性課題，兩個(gè)黑色素瘤基因治療的課題和一個(gè)黑色素瘤全基因組耐藥基因篩查的課題，這三個(gè)課題同時(shí)也是三個(gè)技術(shù)課題成果的應(yīng)用和進(jìn)一步證明。此外還在課題組原有的黑色素母細(xì)胞可逆性永生化的研究基礎(chǔ)上進(jìn)行了SV40-T抗原對(duì)黑色素母細(xì)胞永生化重編程的研究。各個(gè)部分課題相對(duì)獨(dú)立完整又相互關(guān)聯(lián)。
　　Daniel Gibson開發(fā)的Gibson DNA Assembly是一種基于雙鏈DNA分子同源序列進(jìn)行無(wú)

2、縫拼接的DNA連接方式，相較于傳統(tǒng)的基于內(nèi)切酶位點(diǎn)的分子克隆連接方式有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本研究基于DNA Gibson Assembly法，突破以往分子克隆的多種局限性，進(jìn)行了三種分子克隆技術(shù)的革新:一、發(fā)明了無(wú)需重組的腺病毒構(gòu)建系統(tǒng);二、創(chuàng)建了多段干擾序列一步合成共表達(dá)的siRNA表達(dá)系統(tǒng);三、建成了低成本，全基因組覆蓋，簡(jiǎn)便易行，隨機(jī)無(wú)偏性的siRNA文庫(kù)。
　　本課題組在黑色素細(xì)胞的干細(xì)胞生物學(xué)，腫瘤生物學(xué)方面有多年的研究積累。

3、技術(shù)的開發(fā)是為了應(yīng)用，上述分子克隆表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建完成后，我們將這些技術(shù)探索性地用于黑色素瘤基因治療和耐藥靶點(diǎn)篩查的研究，一方面在科研實(shí)踐中驗(yàn)證所革新技術(shù)的功能，另一方面借助新的工具在黑色素瘤治療，黑色素瘤耐藥領(lǐng)域做一些分子機(jī)制研究，希望能為黑色素瘤基因治療，抗耐藥基因篩查的科研與臨床實(shí)踐提供新的方法和理論依據(jù)。
　　此外，基于實(shí)驗(yàn)室的黑素母細(xì)胞可逆性永生化研究基礎(chǔ)，從新發(fā)現(xiàn)的黑素母細(xì)胞永生化細(xì)胞株在體生成畸胎瘤樣組織塊現(xiàn)象出發(fā)，圍繞

4、SV40-T抗原對(duì)黑素母細(xì)胞的重編程現(xiàn)象和機(jī)制展開研究，一方面進(jìn)一步明確SV40-T抗原黑素母細(xì)胞永生化細(xì)胞系的的可行性，安全性及其他可能的潛能。另一方面為傳統(tǒng)的SV40-T抗原永生化細(xì)胞技術(shù)補(bǔ)充理論依據(jù)。
　　主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1.構(gòu)建了無(wú)穿梭質(zhì)粒腺病毒過(guò)表達(dá)載體pROS和pGOS，以pROS為載體，以GFP為目的基因進(jìn)行Gibson Assembly連接，成功繞開穿梭質(zhì)粒和重組的步驟，直接將目的基因連接到完整的腺

5、病毒骨架上。此法獲得陽(yáng)性克隆的效率大于70％，構(gòu)建的腺病毒質(zhì)粒能順利包裝成腺病毒并進(jìn)行擴(kuò)增，病毒感染細(xì)胞后能高效率表達(dá)綠色熒光。這種無(wú)穿梭質(zhì)粒腺病毒構(gòu)建方法效率高，流程簡(jiǎn)單，成本低，避免了重組步驟中突變的高風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)目的基因選擇范圍大，是一種優(yōu)越的腺病毒包裝新技術(shù)。
　　2.構(gòu)建了多段序列siRNA一步合成逆轉(zhuǎn)錄病毒骨架(pSOK)，腺病毒骨架（pAdTrace-OK，pAdTrack-OK）和Piggy-bac質(zhì)粒骨架(pBOK)

6、。設(shè)計(jì)構(gòu)建了含有H1，U6背靠背序列的pB2B質(zhì)粒用于多段序列siRNA嵌入序列的制備。用pSOK為代表，以beta-catenin干擾做測(cè)試，發(fā)現(xiàn)該方法能夠短時(shí)間，低成本，高效率獲得多個(gè)干擾片段同時(shí)連接到同一載體的克隆，在多個(gè)人和小鼠細(xì)胞系的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)該法合成的多序列siRNA表達(dá)系統(tǒng)能高效率發(fā)揮沉默目的基因的功能。是一種優(yōu)良的基因沉默新方法。
　　3.以逆轉(zhuǎn)錄病毒骨架pSOK為載體，化學(xué)合成法隨機(jī)合成的19個(gè)堿基siR

7、NA片段為嵌入序列，用Gibson DNA Assembly方法進(jìn)行連接，構(gòu)建出全基因組覆蓋的siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒隨機(jī)文庫(kù)。經(jīng)菌落PCR，克隆計(jì)數(shù)，測(cè)序，感染后細(xì)胞異質(zhì)性克隆生成觀察等方法鑒定，該文庫(kù)一次合成克隆數(shù)達(dá)到2-3×106，且具有隨機(jī)性和異質(zhì)性，單次使用能夠完全覆蓋哺乳動(dòng)物功能基因表達(dá)譜，且操作過(guò)程簡(jiǎn)單，省時(shí)經(jīng)濟(jì)，在感染小鼠黑素母細(xì)胞系imc23的測(cè)試中表現(xiàn)出較高的感染效率和明確的使細(xì)胞生成異質(zhì)性克隆的功能。是一種優(yōu)良的siR

8、NA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)，科研和臨床應(yīng)用前景廣闊。
　　4.使用無(wú)穿梭質(zhì)粒腺病毒載體構(gòu)建的分泌型IGF-1R結(jié)構(gòu)抑制蛋白表達(dá)腺病毒AdRdnIGF-1 Rα和AdRdnIGF-1Rβ可以明顯抑制人和小鼠黑色素瘤的生長(zhǎng)，其中AdRdnIGF-1 Rβ的效果更明顯。抑制腫瘤生長(zhǎng)的主要原因是促進(jìn)了黑素瘤細(xì)胞的凋亡，也與一定程度上抑制了細(xì)胞進(jìn)入分裂期有關(guān)。提示我們構(gòu)建的分泌型IGF-1R結(jié)構(gòu)抑制蛋白可以作為黑色素瘤基因治療的新的手段，有效抑制黑色

9、素瘤的生長(zhǎng)。同時(shí)也實(shí)踐證明了我們所構(gòu)建的無(wú)穿梭質(zhì)粒腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)效率高，易操作，表達(dá)目的基因的能力強(qiáng)而穩(wěn)定。
　　5.以之前構(gòu)建的多片段siRNA表達(dá)載體pAdTrace-OK為載體，構(gòu)建3個(gè)序列IGF-1R干擾腺病毒AdRhIGF1R-OK（人）和AdRmIGF1R-OK（小鼠）。以人黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375，小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10為細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平和動(dòng)物在體水平證明了我們構(gòu)建的多片段siRNA表達(dá)載體能高效簡(jiǎn)便地構(gòu)建

10、3個(gè)序列IGF-1R干擾腺病毒。導(dǎo)入細(xì)胞后沉默IGF-1R的效果明顯。IGF-1R多片段siRNA序列干擾腺病毒在細(xì)胞與動(dòng)物水平均能有效抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)。抑制腫瘤生長(zhǎng)的主要原因是促進(jìn)了黑素瘤細(xì)胞的凋亡?？梢宰鳛楹谏亓龌蛑委煹男碌氖侄巍?br>　　6.我們以人黑色素瘤A375為細(xì)胞模型，導(dǎo)入構(gòu)建的全基因組siRNA文庫(kù)后針對(duì)目前國(guó)際一線用抗黑色素瘤藥物建立耐藥細(xì)胞克隆。再根據(jù)耐藥克隆中可追蹤的siRNA片段追蹤相對(duì)應(yīng)的抗耐藥基因。目

11、前我們已經(jīng)成功獲得了抗維羅非尼(vemurafenib)的耐藥A375細(xì)胞，其耐藥能力穩(wěn)定而強(qiáng)大，能在維羅非尼水相飽和濃度(100uM)的情況下健康存活，而沒(méi)有導(dǎo)入siRNA文庫(kù)的對(duì)照組A375細(xì)胞在(25uM)時(shí)就沒(méi)有細(xì)胞存活下來(lái)。目前的結(jié)果說(shuō)明我們構(gòu)建siRNA文庫(kù)合成和使用方便，覆蓋率高，隨機(jī)性好，導(dǎo)入細(xì)胞后能強(qiáng)效發(fā)揮基因沉默的功能，使宿主細(xì)胞產(chǎn)生明顯的差異表型?，F(xiàn)在已經(jīng)拿到的耐藥人黑色素瘤細(xì)胞克隆是本實(shí)驗(yàn)的限速步驟，這一步的完成

12、一方面證明了我們的實(shí)驗(yàn)方案的可行性，另一方面是后續(xù)的實(shí)驗(yàn)順理成章做下去的關(guān)鍵基礎(chǔ)。有望為維羅非尼的臨床耐藥的機(jī)制研究提供新的線索，為新藥改良，補(bǔ)充治療尋找新的靶點(diǎn)。
　　7.證明了SV40-T永生化的黑素母細(xì)胞imcx相較原代黑素母細(xì)胞發(fā)生了重編程，在發(fā)育階段上更為原始，分化潛能增加，而這一變化與SV40-T相關(guān)。imcx細(xì)胞中ips四個(gè)因子除Sox2以外均升高，多種多項(xiàng)潛能相關(guān)基因，神經(jīng)脊特異性基因的表達(dá)升高，成球能力增強(qiáng)等均提

13、示SV40-T的導(dǎo)入使原代黑素母細(xì)胞發(fā)生了去分化，變成了發(fā)育階段上更早期的細(xì)胞。黑素譜系分化相關(guān)指標(biāo)與預(yù)期不同，不降反升，可能與重編程后imcx仍能保持強(qiáng)大的向黑色素譜系終末分化的潛能相關(guān)。Sox2在SV40-T介導(dǎo)的黑素母細(xì)胞重編程中不是必須的，甚至可能是不被允許高表達(dá)的。imcx相較原代黑素母細(xì)胞分化潛能增加，具有兩個(gè)胚層以上，至少4種細(xì)胞分化方向的潛能。imcx高表達(dá)三個(gè)胚層的一些分子標(biāo)記，在二維培養(yǎng)和動(dòng)物在體移植水平證明了imc

14、x具有向黑色素細(xì)胞，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，骨組織，脂肪組織的進(jìn)行終末分化的潛能，在體移植生成的組織塊呈畸胎瘤樣組織學(xué)特點(diǎn)。用E2f熒光報(bào)告系統(tǒng)，p53熒光報(bào)告系統(tǒng)，imcx細(xì)胞水平和動(dòng)物在體水平逐個(gè)過(guò)表mcx相較原代黑素母細(xì)胞分化潛能增加，具有兩個(gè)胚層以上，至少4種細(xì)胞分化方向的潛能。imcx高表達(dá)三個(gè)胚層的一些分子標(biāo)記，在二維培養(yǎng)和動(dòng)物在體移植水平證明了imcx具有向黑色素細(xì)胞，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，骨組織，脂肪組織的進(jìn)行終末分化的潛

15、能，在體移植生成的組織塊呈畸胎瘤樣組織學(xué)特點(diǎn)。過(guò)表達(dá)達(dá)ips4個(gè)因子觀察其分化程度和成畸胎瘤能力變化等實(shí)驗(yàn)手段對(duì)SV40-T重編程小鼠黑素母細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行了初步探索。E2f的升高，p53的降低可能與SV40-T重編程小鼠黑素母細(xì)胞相關(guān)。在imcx中各個(gè)加入ips四個(gè)因子，均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞水平產(chǎn)黑素量增多，細(xì)胞傾向于分化。尤其是Oct4較為明顯。在體移植時(shí)，加入不同ips因子的imcx成畸胎瘤的情況出現(xiàn)明顯差異。提示C-Myc與SV40-T有