重組SV40大T抗原慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、研究背景與目的:SV40大T抗原是由SV40病毒早期編碼區(qū)編碼的一種多功能磷酸蛋白,在病毒復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。SV40大T抗原具有活化宿主細(xì)胞核糖體基因、誘導(dǎo)DNA合成、修飾蛋白質(zhì)合成起始因子等作用,并且能結(jié)合、調(diào)控某些關(guān)鍵性的細(xì)胞調(diào)控蛋白,如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白家族成員(如pRB)、腫瘤抑制因子p53等,誘導(dǎo)多種細(xì)胞的永生化。通過(guò)對(duì)SV40大T抗原介導(dǎo)的永生化細(xì)胞系的深入研究發(fā)現(xiàn),SV40大T抗原基因與宿主細(xì)胞DNA穩(wěn)定整合重組后

2、,不但能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)SV40大T抗原,加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)速率,同時(shí)也能保留原始細(xì)胞的許多分化表型,具有相對(duì)穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài),而非原始基因的表達(dá)很少見(jiàn)。因此,通過(guò)建立SV40大T抗原所介導(dǎo)的永生化細(xì)胞系,不僅有助于了解細(xì)胞的增殖與衰老的分子機(jī)制,為我們攻克腫瘤和延緩衰老提供理論依據(jù)。同時(shí)可多次傳代的永生化細(xì)胞,以其具有的相對(duì)穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài),可以作為標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞應(yīng)用在細(xì)胞工程和組織工程等研究領(lǐng)域的。本課題擬構(gòu)建含有重組SV40

3、大T抗原基因的慢病毒表達(dá)載體pLentiGFP-Tag,轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系293FT獲得重組慢病毒,通過(guò)感染真核細(xì)胞,觀察所構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的整合情況及所攜帶的SV40大T抗原的表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞傳代的作用,為研究和建立SV40大T抗原介導(dǎo)下的永生化細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。
　　方法:以含有SV40大T抗原基因的質(zhì)粒為模板,通過(guò)PCR克隆出SV40大T抗原基因作為靶基因;將靶基因連接到pGEM-T Easy載體上,以pGEM-T-

4、Tag克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109,利用Amp抗性和藍(lán)白篩選試驗(yàn)篩選出含有所需的pGEM-T-Tag質(zhì)粒的白色菌落,以T7/SP6為引物擴(kuò)增靶基因來(lái)確認(rèn)所需的陽(yáng)性克隆,并進(jìn)行DNA測(cè)序以確認(rèn)克隆的靶基因的準(zhǔn)確性;將重組質(zhì)粒pGEM-T-Tag和慢病毒載體pLentiGFP同時(shí)用BamHⅠ酶切,電泳膠回收純化后對(duì)線性載體pLentiGFP進(jìn)行羥化處理,再將線性載體pLentiGFP與靶基因SV40大T抗原基因連接,以重組載體

5、pLentiGFP-Tag轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α,將培養(yǎng)出的菌落以亞克隆鑒定引物L(fēng)1/T2為引物鑒定出陽(yáng)性克隆(正插重組子)。將篩選出的陽(yáng)性克隆表達(dá)載體pLentiGFP-Tag與慢病毒輔助包裝載體共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,培養(yǎng)產(chǎn)生出慢病毒顆粒。以慢病毒顆粒感染家兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞,通過(guò)觀察重組慢病毒所攜帶的EGFP基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及進(jìn)行RT-PCR的檢測(cè)確認(rèn)重組慢病毒與宿主細(xì)胞的整合和SV40大T抗原基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。其后進(jìn)行感

6、染細(xì)胞的連續(xù)傳代培養(yǎng),觀察SV40大T抗原對(duì)細(xì)胞傳代生長(zhǎng)的作用。
　　結(jié)果:1.靶基因的擴(kuò)增及電泳分析:以含有SV40大T抗原基因的質(zhì)粒為模板,目的基因擴(kuò)增引物T1/T2為引物通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增得到與SV40大T抗原基因片段大小相符的約2154bp的基因片段,電泳分析證實(shí)。2.靶基因的克隆及鑒定:靶基因與pGEM-T Easy載體連接后,組成重組質(zhì)粒pGEM-T-Tag,經(jīng)由轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109,藍(lán)白篩選試驗(yàn)后隨機(jī)選

7、取其中的4個(gè)陽(yáng)性菌落,以克隆鑒定引物T7/SP6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均得到大小約為2330bp的基因片段,為陽(yáng)性克隆,再由DNA測(cè)序后確認(rèn)與SV40大T抗原基因序列一致。3.靶基因的亞克隆及重組子的鑒定:將羥化后的pLentiGFP雙粘質(zhì)粒與雙粘靶片段SV40大T抗原基因相連接,組成重組子pLentiGFP-Tag,轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α后,對(duì)4個(gè)陽(yáng)性克隆以亞克隆鑒定引物L(fēng)1/T2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中有3個(gè)克隆的擴(kuò)增產(chǎn)

8、物大小約為2274bp,為陽(yáng)性克隆(正插重組子)。4.重組慢病毒的包裝純化及滴定:將篩選出的陽(yáng)性克隆表達(dá)載體pLentiGFP-Tag與慢病毒輔助包裝載體pΔ8.2和pVSVG共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞48~72小時(shí)后,離心獲得pLentiGFP-Tag包裝的慢病毒,病毒滴度為2.4×10~6IU/ml。5.重組慢病毒的感染及靶基因的表達(dá):在表達(dá)Tag的慢病毒感染家兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞48小時(shí)后觀測(cè)到綠色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)的廣泛表達(dá),空白對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)

9、綠色熒光蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)RT-PCR檢測(cè)到表達(dá)Tag的慢病毒感染組細(xì)胞內(nèi)有SV40大T抗原mRNA的高水平表達(dá),對(duì)照組均為陰性。6.SV40大T抗原對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用:表達(dá)Tag的慢病毒感染組細(xì)胞培養(yǎng)至第10代,依然生長(zhǎng)良好。對(duì)照組細(xì)胞5代后全部死亡。表明pLentiGFP-Tag包裝的慢病毒感染兔BMSCs細(xì)胞后,可以顯著提高原代培養(yǎng)兔BMSCs細(xì)胞的傳代次數(shù)。
　　結(jié)論:本試驗(yàn)利用分子生物學(xué)方法,成功構(gòu)建了攜帶有SV40大