SV40T抗原基因誘導(dǎo)可逆性永生化黑素細(xì)胞的生物學(xué)特征評價.pdf

1、正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)時生命期是有限的，細(xì)胞增殖一段時間后會出現(xiàn)群體生長緩慢，有絲分裂停滯，進(jìn)而衰老死亡，這種現(xiàn)象叫做復(fù)制衰亡(replicativesenescence)。細(xì)胞的這種生物學(xué)現(xiàn)象導(dǎo)致一些體外培養(yǎng)的細(xì)胞因生長增殖能力衰竭、數(shù)量不足而不能充分滿足實驗研究和臨床運(yùn)用的要求。后來人們觀察到一些腫瘤細(xì)胞具有持續(xù)生長和增殖的能力，可長期傳代，即細(xì)胞的永生化(immortalization)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)部分永生化的腫瘤細(xì)胞中含有病毒基

2、因(virusgene)，因此通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將病毒基因?qū)氩⒄显隗w外培養(yǎng)的正常細(xì)胞基因組上，使其出現(xiàn)永生化就成為了細(xì)胞實驗研究的熱門。 猿猴病毒40(simianvirus40，SV40)是60年代初發(fā)現(xiàn)和分離的猴腎細(xì)胞病毒，人是其自然宿主。SV40的基因組能編碼T(LargeT)和t(smallt)抗原。T抗原具有ATP酶和DNA解旋酶活性，使蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化、ADP核糖基化和己酰基化。T抗原還有活化宿主細(xì)胞核糖

3、體基因、誘導(dǎo)DNA合成、修飾蛋白質(zhì)合成起始因子等作用。t抗原能反式激活RNA多聚酶基因的啟動子，以及c-myc和c-fos癌基因轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞質(zhì)肌動蛋白缺失和細(xì)胞粘附性下降。T抗原為細(xì)胞轉(zhuǎn)化啟動所必需的，對轉(zhuǎn)化起決定作用，而且轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型的維持必須要T抗原的連續(xù)表達(dá)。t抗原對細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是非必需的，但可起加強(qiáng)作用，兩者共同維持轉(zhuǎn)化表型。因此SV40T抗原基因被廣泛運(yùn)用于誘導(dǎo)人類和動物細(xì)胞的永生化。 SV40T抗原引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化是一個復(fù)

4、雜的過程，目前仍不完全清楚其機(jī)制。一些研究發(fā)現(xiàn)SV40T抗原能與腫瘤抑制因子pRb和p53相互作用，影響它們調(diào)控正常細(xì)胞生長周期和細(xì)胞凋亡的功能，也有研究認(rèn)為SV40T抗原基因可通過調(diào)節(jié)端粒酶的活性使細(xì)胞的端粒長度得到維持。細(xì)胞的永生化被認(rèn)為可能是向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的必經(jīng)階段，因其安全性受到質(zhì)疑制約了轉(zhuǎn)化細(xì)胞運(yùn)用于臨床的前景。 我科前期實驗利用位點(diǎn)特異性重組酶Cre/loxP系統(tǒng)聯(lián)合SV40T抗原基因成功構(gòu)建了可逆性永生化黑素細(xì)胞(

5、reversibleimmortalizedmelanocytes，RIMC)。其基本原理是利用基因打靶技術(shù)，引入Cre/loxP系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有高度保守性和特異性，可準(zhǔn)確的根據(jù)loxP位置切除整合在細(xì)胞基因組的外源性SV40T抗原基因。實驗研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞S-100、HMB-45等細(xì)胞表型未發(fā)生改變，而且軟瓊脂克隆實驗和裸鼠移植實驗也未觀察到致瘤性。為進(jìn)一步了解SV40T抗原基因?qū)φT導(dǎo)的RIMC生物學(xué)性狀和功能，特別是潛在致瘤性的影響，

6、我們對培養(yǎng)至第15代的IMC(immortalizedmelanocytes，IMC)進(jìn)行染色體分析，免疫組織化學(xué)方法檢測HLA-DR和hTERT蛋白的表達(dá)，RTI-PCR檢測hTERTmRNA表達(dá)；對第20代細(xì)胞進(jìn)行MTT比色法分析細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和DNA倍體；RT-PCR半定量分析細(xì)胞hMLH1、hMSH2錯配修復(fù)基因表達(dá)；并提取細(xì)胞基因組，對1p22(D1S187)、5q14(D5S107)、18q12.2-1

7、2.3(D18S34)三個位點(diǎn)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺電泳分析微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatelliteinstability,MI)；同時對細(xì)胞的酪氨酸酶活性和黑素含量與正常MC進(jìn)行對比，分析細(xì)胞的生物學(xué)功能變化。結(jié)果表明永生化和去永生化的黑素細(xì)胞均保持正常核型、HLA-DR的表達(dá)不受體外長期傳代培養(yǎng)和SV40T抗原的影響；SV40T抗原不通過上調(diào)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性途徑介導(dǎo)細(xì)胞永生化；細(xì)胞周期分析和MTT比色法分析細(xì)胞增殖實驗表

8、明IMC的生長增殖較正常MC明顯，長期培養(yǎng)未見復(fù)制衰亡現(xiàn)象。而切除SV40T抗原基因后的去永生化黑素細(xì)胞可出現(xiàn)部分凋亡，生長變緩；錯配修復(fù)基因hMLH1、hMSH2在IMC中較正常細(xì)胞表達(dá)上調(diào)；D1S187、D5S107、D18S34三個位點(diǎn)上均未出現(xiàn)條帶的增加和缺失，無微衛(wèi)星不穩(wěn)定性發(fā)生，保持了細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性。細(xì)胞的酪氨酸酶活性和黑素含量與體外培養(yǎng)的正常MC無明顯差別。上述結(jié)果說明轉(zhuǎn)化細(xì)胞不易向惡性轉(zhuǎn)化，并能保持MC正常的黑素代謝的