SV40T基因介導(dǎo)永生化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞重新編程及可能機(jī)制研究.pdf

1、第一部分永生化細(xì)胞系的建立及驗(yàn)證
　　目的：建立穩(wěn)定、可無限傳代的永生化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系，為體外神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生理及病理研究提供穩(wěn)定、可靠的細(xì)胞來源。
　　方法：體外培養(yǎng)原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（primary glia，pGlia），利用攜帶 SV40T基因的工具質(zhì)粒 pMPH86和攜帶轉(zhuǎn)座酶基因的腺病毒AdR-pBase共轉(zhuǎn)染使SV40T基因在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，以10％的細(xì)胞密度接種pGlia和永生化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（immorta

2、lized glia，iGlia）在24孔板中，于1天、3天、5天、7天進(jìn)行可視細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算倍增時(shí)間、WST-1試驗(yàn)、結(jié)晶紫染色測定增殖能力，以相同密度接種原代膠質(zhì)細(xì)胞和永生化膠質(zhì)細(xì)胞在T25培養(yǎng)瓶中，24小時(shí)收集細(xì)胞做流式細(xì)胞技術(shù)（FACS）測定細(xì)胞周期。采用免疫熒光染色檢測各神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物GFAP、s100b、O4、MBP的表達(dá)情況，RT-PCR、TqPCR比較pGlia和iGlia中各表面標(biāo)志物的表達(dá)。AdFLP敲除SV

3、40T后分別用TqPCR和RT-PCR驗(yàn)證其敲除效率，采用結(jié)晶紫染色、WST-1及FACS測定SV40T敲除后增殖能力的改變。
　　結(jié)果：（1）以10%的細(xì)胞密度接種pGlia和iGlia在24孔板中，于1天、3天、5天、7天進(jìn)行可視細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，第1天兩組細(xì)胞數(shù)目基本一致，iGlia組細(xì)胞不斷增殖，第7天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)增加到原來的10倍左右；而pGlia組在整個(gè)培養(yǎng)過程中數(shù)量增加不明顯，增殖緩慢。計(jì)算兩組細(xì)胞倍增時(shí)間發(fā)現(xiàn)iGl

4、ia約每24小時(shí)增殖分裂1次，而pGlia倍增時(shí)間約3天。WST-1試驗(yàn)、結(jié)晶紫染色均提示iGlia組細(xì)胞增殖活性及斜率明顯高于pGlia組。FACS測定細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)pGlia組60.8％細(xì)胞處于G1期，表現(xiàn)出G1期阻滯未能進(jìn)入DNA復(fù)制期，有絲分裂明顯受到抑制。而iGlia組81.8％細(xì)胞處于S期+ G2期，即大部分細(xì)胞處于 DNA復(fù)制期及有絲分裂準(zhǔn)備期，表明該組細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖分裂能力。（2）免疫熒光染色發(fā)現(xiàn) iGlia均表達(dá) G

5、FAP、s100b、O4、MBP等神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物， RT-PCR和 TqPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)iGlia較pGlia表達(dá) GFAP、vimentin明顯下調(diào)，而MBP表達(dá)明顯上調(diào)，S100b未見明顯變化，表明永生化后少突膠質(zhì)細(xì)胞比例增加，細(xì)胞構(gòu)成比改變。（3）AdFLP能成功敲除SV40T，結(jié)晶紫染色、WST－1及FACS等結(jié)果均表明SV40T敲除后iGlia增殖能力得以逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論：SV40T基因以piggyBac系統(tǒng)為載體

6、轉(zhuǎn)入神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，成功建立可逆轉(zhuǎn)的永生化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系（iGlia），該細(xì)胞系中星型膠質(zhì)細(xì)胞比例降低，少突膠質(zhì)細(xì)胞比例增加，細(xì)胞構(gòu)成比發(fā)生改變，但其穩(wěn)定表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志物，可作為體外神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生理和病理研究的工具細(xì)胞。
　　第二部分 SV40T介導(dǎo)iGlia重新編程
　　目的：明確iGlia細(xì)胞構(gòu)成比改變原因，并確認(rèn)SV40T基因是否啟動(dòng)iGlia重新編程。
　　方法：體外培養(yǎng)pGlia和iGlia，分別

7、提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過TqPCR和RT-PCR的方式比較兩種細(xì)胞系多種多潛能干細(xì)胞標(biāo)志物和傳統(tǒng)重組因子、三胚層標(biāo)志物的表達(dá)情況。在無血清條件下進(jìn)行擬器官誘導(dǎo)培養(yǎng)pGlia和iGlia，觀察細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞團(tuán)生長情況，并做免疫熒光及RT-PCR明確各多潛能干細(xì)胞標(biāo)志物及三胚層標(biāo)志物表達(dá)情況。在體移植iGlia明確細(xì)胞生長狀況及安全性。分別從體外、體內(nèi)Ad-BMP9和Ad-GFP感染iGlia，通過ALP檢測、ALP染色、Al

8、cian Blue染色、Trichrome染色、HE染色、microCT等方法確認(rèn)其骨分化潛能。
　　結(jié)果：（1）TqPCR篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iGlia多種多潛能干細(xì)胞標(biāo)志物上調(diào)，并表達(dá)三胚層標(biāo)志物增多，表明iGlia具有了干細(xì)胞特性。擬器官培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)iGlia可培養(yǎng)成類器官，而pGlia培養(yǎng)中不能存活，對其免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)iGlia－GFP組較iGlia－FLP組干性標(biāo)志物表達(dá)增多，而分化標(biāo)志物表達(dá)減少，RT－PCR發(fā)現(xiàn)iGlia表達(dá)

9、三胚層表面標(biāo)志物，提示其可能具有分化成三胚層的能力。用 BMP9可在體及體外誘導(dǎo)iGlia分化成骨和軟骨，而pGlia不具有分化成骨的能力，表明SV40T賦予iGlia從外胚層分化成中胚層組織的能力。
　　結(jié)論：SV40T的插入賦予了 iGlia無限傳代和多向分化潛能的干細(xì)胞特性，表明SV40T啟動(dòng)了iGlia的重新編程，這可能是細(xì)胞構(gòu)成比改變的原因。
　　第三部分重新編程的可能機(jī)制探索
　　目的：探索SV40T介導(dǎo)重

10、新編程的可能機(jī)制。
　　方法：采用TqPCR篩查iGlia和pGlia中DNA去甲基化和RNA甲基化的酶的表達(dá)情況，采用reporter－E2F和reporter－p53標(biāo)記iGlia后gluc讀值測定SV40T敲除前后p53通路和Rb／E2F通路中P53和E2F的變化情況，推測其是否參與SV40T的重新編程。
　　結(jié)果：（1）iGlia中Tet1/2/3表達(dá)明顯高于pGlia，表明DNA去甲基化明顯增強(qiáng)（2）iGlia－F