固體脂質(zhì)納米粒的小腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究及其載體構(gòu)建.pdf

1、納米給藥系統(tǒng)在改善藥物口服吸收的應(yīng)用方面發(fā)展迅速，與傳統(tǒng)的口服遞藥系統(tǒng)相比，納米給藥系統(tǒng)有其不可替代的優(yōu)勢，如給藥后可以廣泛地分布到胃腸道中增加藥物吸收，包裹被包封的藥物免受胃腸道酸性環(huán)境和酶的降解，控制藥物的釋放速度，通過一定的修飾可以達(dá)到靶向效果。固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipidnanoparticels，SLNs)作為口服納米給藥系統(tǒng)近年來受到廣泛關(guān)注，由于其制備材料為生物相容性及生物可降解性的固態(tài)脂質(zhì)材料，因此被認(rèn)為是最有

2、希望開發(fā)成臨床應(yīng)用的納米給藥系統(tǒng)。雖然固體脂質(zhì)納米粒在口服給藥方面顯現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢，但是其在胃腸道中的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收機(jī)制的研究報(bào)道還很少。全面認(rèn)識(shí)和掌握固體脂質(zhì)納米粒在胃腸道中的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收機(jī)制對(duì)我們?cè)O(shè)計(jì)高效口服吸收的制劑具有重要的指導(dǎo)作用。本課題詳細(xì)研究了固體脂質(zhì)納米粒在小腸上皮細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，通過比較不同結(jié)構(gòu)修飾的固體脂質(zhì)納米粒的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制差別，得出了跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率高的固體脂質(zhì)納米粒所具有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
　　以單硬脂酸甘油酯為脂質(zhì)材料，

3、采用水性溶劑擴(kuò)散法制備了固體脂質(zhì)納米粒。以十八胺-異硫氰基熒光素(ODA-FITC)為熒光探針標(biāo)記固體脂質(zhì)納米粒(ODA-FITC-SLNs)。將金納米粒包裹到固體脂質(zhì)納米粒（Au-SLNs）中用于細(xì)胞樣本的透射電鏡分析。制備的三種固體脂質(zhì)納米粒的粒徑相似，約為100nm，粒徑均勻。固體脂質(zhì)納米粒分散液在一周的貯存期內(nèi)，質(zhì)量未發(fā)生明顯改變。
　　體外構(gòu)建MDCK細(xì)胞單層來研究固體脂質(zhì)納米粒的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程。加入到Transwell上

4、室中的固體脂質(zhì)納米粒大約有20％的量攝取進(jìn)入細(xì)胞單層，大約有2.5％的量實(shí)現(xiàn)了跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。透射電鏡結(jié)果顯示固體脂質(zhì)納米粒能夠以完整的粒子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。固體脂質(zhì)納米粒的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)細(xì)胞單層的頂側(cè)膜以及細(xì)胞單層的緊密連接結(jié)構(gòu)沒有影響。MDCK細(xì)胞對(duì)固體脂質(zhì)納米粒的攝取是一個(gè)時(shí)間和能量依賴的過程。攝取過程首先是固體脂質(zhì)納米粒粘附于細(xì)胞膜上，吸附過程會(huì)顯著降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性。透射電鏡結(jié)果顯示細(xì)胞攝取固體脂質(zhì)納米粒是囊泡介導(dǎo)的過程。固體脂質(zhì)納米粒的跨

5、膜轉(zhuǎn)運(yùn)主要是以網(wǎng)格蛋白結(jié)構(gòu)、脂筏結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的過程，并且肌動(dòng)蛋白微絲在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著一定的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、微管蛋白在固體脂質(zhì)納米粒的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)可能存在直接的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，將固體脂質(zhì)納米粒直接由頂層膜轉(zhuǎn)運(yùn)至基底側(cè)。
　　我們進(jìn)一步構(gòu)建了Caco-2細(xì)胞單層模型來考察固體脂質(zhì)納米粒的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，并與其在MDCK細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制做了比較。首先研究了固體脂質(zhì)納米粒在Caco-2細(xì)胞中的細(xì)胞毒理學(xué)性質(zhì)

6、。研究結(jié)果表明，固體脂質(zhì)納米粒對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性較低，不會(huì)影響細(xì)胞膜的完整性，不會(huì)引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，能夠顯著降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性。首次采用全內(nèi)反射熒光顯微鏡技術(shù)直觀地證明了固體脂質(zhì)納米粒的內(nèi)吞和外排是囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。固體脂質(zhì)納米粒在Caco-2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與在MDCK細(xì)胞中的大致相同，但是在Caco-2細(xì)胞中，巨胞飲途徑在固體脂質(zhì)納米粒的內(nèi)吞以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著一定的作用。固體脂質(zhì)納米粒在Caco-2細(xì)胞單層中的跨膜轉(zhuǎn)

7、運(yùn)量明顯低于其在MDCK細(xì)胞單層中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量，并且在Caco-2細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)更依賴于能量的過程。
　　設(shè)計(jì)了不同結(jié)構(gòu)修飾的固體脂質(zhì)納米粒，包括采用不同碳鏈長度的脂質(zhì)材料以及對(duì)納米粒表面進(jìn)行不同PEG量的修飾。體外構(gòu)建MDCK細(xì)胞單層，并對(duì)不同結(jié)構(gòu)修飾的固體脂質(zhì)納米粒進(jìn)行了跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的比較以及相應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的分析。研究結(jié)果表明，隨著脂質(zhì)材料碳鏈長度的增加，固體脂質(zhì)納米粒攝取進(jìn)入細(xì)胞單層和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的量降低。跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制分析表明

8、，低碳鏈長度的固體脂質(zhì)納米粒更容易經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，隨著碳鏈長度的增加經(jīng)這種轉(zhuǎn)運(yùn)通路轉(zhuǎn)運(yùn)的納米粒的量明顯減少。一定量的PEG修飾(PEG-20％)不但可以增加固體脂質(zhì)納米粒攝取進(jìn)入細(xì)胞單層的量，而且可以顯著增加其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的量。其機(jī)制分析表明，一定量的PEG修飾可以增加其通過網(wǎng)格蛋白結(jié)構(gòu)和脂筏/小窩蛋白結(jié)構(gòu)攝取進(jìn)入細(xì)胞單層的量，并且可以增加經(jīng)直接跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑轉(zhuǎn)運(yùn)的比例，減少經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)。通過大鼠的離體腸