脂質納米載體的細胞轉運與抗腫瘤藥效研究.pdf

1、固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是繼乳劑、脂質體、微粒和毫微粒后近年來研究十分活躍的靶向控釋膠粒給藥系統(tǒng)。sLN在室溫下通常呈現固態(tài)，具有聚合物納米粒物理穩(wěn)定性高、藥物泄漏少的優(yōu)勢，又兼有脂質體、乳劑的毒性低優(yōu)點，是一種潛在的新型給藥系統(tǒng)。作為一種新型給藥系統(tǒng)，SLN具有廣闊的發(fā)展前景，但是，sLN也存在一些潛在的局限性，如有限的載藥能力、儲存過程的藥物排擠現象等問題。納米結構脂質載體(nan

2、ostructured lipidCarrier．NLC是新一代的脂質納米粒。NLC由幾種熔點不同的固液脂質混合物作為基質。液體脂質的加入，可擾亂固體脂質規(guī)則的晶格結構，增加納米粒結構中不規(guī)則晶型的比例，使承載脂溶性藥物的空間容量增加，從而提高載體的載藥能力。通過控制液體脂質比例，還可使NLc在體溫下保持固體骨架結構，實現NLC藥物的控制釋放。 本研究以異硫氰基熒光素的異硫氰基與硬脂胺的氨基的偶合反應制備得到的硬脂胺-異硫氰基熒

3、光素(octadecylamine-fluorescein isothiocyanate，ODA-FITC)為熒光標記物，通過溶劑擴散法制備熒光標記脂質納米載體。以A549肺癌細胞為模型細胞，考察不同脂質納米載體的細胞轉運。研究表明，A549細胞攝取不同脂質材料固體脂質納米粒的能力高低順序為三硬脂酸甘油酯(三甘酯)sLN>單硬脂酸甘油酯(單甘酯)sLN>硬脂酸SLN>山崳酸甘油酯sLN。在此基礎上，本研究以抗腫瘤藥物紫杉醇為藥物模型，制

4、備負載紫杉醇的固體脂質納米粒，考察納米粒的粒徑、電位、藥物包封率、載藥量、細胞轉運能力與紫杉醇固體脂質納米粒的細胞毒性的相互關系。研究表明，與游離藥物溶液(溶劑為Cremophor：無水乙醇=1：l(V/V))相比，紫杉醇經固體脂質納米粒包封后，藥物的細胞毒性顯著增強，其中以單甘酯sLN的細胞藥效最佳；以具有快速細胞轉運能力的三甘酯為基本材料制備的紫杉醇SLN，由于其較低的載藥量和包封率，并未顯示出較高的細胞毒性。經聚乙二醇單硬脂酸酯(

5、polyethylene glycol monostearate，PEG-SA，乙二醇聚合度為40)修飾后的單甘酯SLN，細胞攝取增加，但其在細胞水平的藥效未見增加。納米粒的細胞攝取可通過受體介導的內吞來進一步優(yōu)化。大多數腫瘤細胞表面的葉酸受體數目和活性明顯高于正常細胞，因此用傳統(tǒng)方法難以治療的惡性腫瘤可以通過葉酸受體的介導進行靶向治療。本研究進一步合成了葉酸．硬脂酸嫁接物(folic acid-stearic acid，FA-SA)，

6、通過溶劑擴散法制備葉酸修飾單甘酯固體脂質納米粒。利用葉酸受體在多種腫瘤細胞表面高度表達的特點，以期實現固體脂質納米粒的高效腫瘤細胞攝取。研究表明，經FA-SA修飾后，單甘酯固體脂質納米粒的細胞攝取與其給藥系統(tǒng)在細胞水平的藥效均有所增加。 以單甘酯為固體脂質材料，油酸為液體脂質材料，溶劑擴散法制備納米結構脂質載體(nanostructured lipid carriers，NLC)。以A549細胞為模型細胞，用ODA-FITC標記

7、含不同比例液體脂質的NLC，熒光倒置顯微鏡觀察并比較細胞對含不同比例液體脂質的NLC的攝取能力，并測定熒光強度。研究表明，NLC的細胞攝取隨著脂質材料中油酸比例的增加而增加。以紫杉醇為模型藥物，制備載藥NLC。隨著油酸含量的增加，NLC的藥物包封率、載藥量、藥物釋放速率隨之增加。體外細胞毒性實驗結果顯示：空白NLC為低細胞毒性載體；與游離藥物相比，載紫杉醇的NLC的細胞毒性顯著增強，且隨著油酸比例的增加而增加。本研究合成了FA-SA用于

8、修飾NLC來實現葉酸受體介導的納米粒細胞攝取，結果發(fā)現與游離藥物相比，葉酸修飾NLc在細胞水平的藥效提高了86倍。 多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是當前臨床上惡性腫瘤化療失敗的主要因素之一。在目前所發(fā)現的導致腫瘤細胞產生MDR的機制中，最普遍也是研究最廣泛的是P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP)的作用，P-gp以ATP能量依賴的方式主動地將藥物(主要是疏水性藥物，如紫杉醇、阿霉素等)從

9、細胞內“泵出”到細胞外，使細胞內藥物濃度下降，導致細胞毒作用減弱或喪失，產生耐藥現象。有研究表明，納米粒給藥系統(tǒng)可以保護包封藥物進入細胞,避免P-gP藥泵的作用，從而克服耐藥性。本研究進一步考察了脂質納米載體的逆轉耐藥腫瘤細胞的耐藥作用。以乳腺癌細胞MCF-7敏感株、MCF-7耐藥株(MCF-7/ADR)為模型細胞，用四唑鹽比色法(MTF Assay)法分別評價載紫杉醇或阿霉素SLN和NLC在敏感和耐藥株上的毒性，考察SLN和NLC給藥

10、系統(tǒng)的藥效和逆轉多藥耐藥細胞的耐藥性能力。 與游離藥物溶液比較，sLN和NlJc包封紫杉醇和阿霉素后，有效地增強了它們對MCF-7和MCF-7/ADR的細胞毒性，紫杉醇SLN和阿霉素sLN對MCF-7耐藥細胞的逆轉倍數分別為31.0和4.3，紫杉醇NLC和阿霉素NLC對MCF-7耐藥細胞的逆轉倍數分別為34.3和6.4。經FA-SA修飾后，葉酸修飾紫杉醇NLc和阿霉素NLC對MCF-7/ADR的逆轉倍數分別增加至52.2和8.3