紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因nad的克隆與再生體系的初探.pdf

1、紅麻是我國重要的纖維作物之一,它的纖維品質(zhì)良好且用途廣泛,具有重要的應(yīng)用價(jià)值,因此被視為21世紀(jì)極具發(fā)展?jié)摿Φ亩嘤猛咀魑?。和其他作物一?利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系培育紅麻雜交品種成為目前紅麻育種的主要研究方向。
　　 利用作物的細(xì)胞質(zhì)雄性不育性(CytoplasmicMaleSterility,CMS)是作物的雜種優(yōu)勢利用的主要途徑,而CMS的機(jī)理又非常復(fù)雜,因此有關(guān)CMS的研究也成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)課題。大量的研究表明,

2、細(xì)胞質(zhì)雄性不育與線粒體DNA的變異有密切的聯(lián)系。本課題組前期的工作通過SRAP分子標(biāo)記技術(shù)證實(shí)線粒體nad基因片段在不育系和保持系中存在差異。為了更好的研究細(xì)胞質(zhì)雄性不育與線粒體DNA之間的關(guān)系,本研究以紅麻不育系P3A及相應(yīng)保持系P3B為實(shí)驗(yàn)材料,建立了分離高質(zhì)量紅麻線粒體DNA的方法,重點(diǎn)克隆了可能與紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因nad1、nad2和nad3;同時(shí)對(duì)基因nad1～9進(jìn)行了半定量RT-PCR分析;對(duì)紅麻再生體系建立進(jìn)行了初

3、步探索,主要結(jié)果如下:
　　 (1)采用紅麻黃化苗為材料,結(jié)合密度梯度離心和差速離心的方法提取線粒體DNA(mtDNA),結(jié)果顯示蔗糖密度梯度離心法比Percoll密度梯度離心法更適合于紅麻線粒體的分離。提取的mtDNA經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計(jì)檢測,并設(shè)計(jì)葉綠體和核特異性基因引物檢測是否有污染存在,結(jié)果顯示此方法提取的mtDNA純度高,沒有污染。
　　 (2)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫nad基因保守序列設(shè)計(jì)簡并引

4、物,利用PCR擴(kuò)增在不育系和保持系中分別獲得了nad1、nad2、nad3基因的保守序列,其長度為817bp、1052bp、235bp,把這些片段的基因序列與甜菜和毛竹、煙草、西瓜比對(duì),其同源性分別達(dá)到98.2％、96.7％、97％,說明所擴(kuò)增的片段為正確片段。并將同一基因序列在兩系之間比較,發(fā)現(xiàn)只有個(gè)別堿基不同。其中nad1基因有2個(gè)堿基不同,分別為P3A中第115位由A→G、第411位由A→G,P3B在第247位缺失了一個(gè)A堿基,兩

5、系同源性達(dá)到99.6％。Nad2基因在P3A中第189位缺失一個(gè)T堿基,第206位由G→A,第477位由A→G,第863位由A→G,第936位由C→T,同源性達(dá)到99.5％。而nad3基因只有一個(gè)堿基的差異,即第94位由G→A,同源性為99.6％。半定量RT-PCR分析得出,nad1,nad2、had3、had4、had5基因表達(dá)量在兩系之間沒有明顯差異。nad4L、nad6不育系的表達(dá)量相對(duì)保持系較高。Nad7、nad9不育系的表達(dá)量

6、相對(duì)保持系較低。
　　 (3)紅麻再生體系建立初步研究得出,在培養(yǎng)條件為25±1℃,光照時(shí)間14h/d,光照強(qiáng)度為21001x左右左右的條件下,以紅麻胚為外植體材料,誘導(dǎo)愈傷較適宜的培養(yǎng)基配方為:處理A6:MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D,能誘導(dǎo)出能力強(qiáng)的愈傷組織,其量多、黃綠色、質(zhì)地緊實(shí),愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生頻率高達(dá)100％。分化培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基,添加0.5-2.5mg/mL的6-BA和0.1-0.S