輸卵管與輸卵管內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、本文內(nèi)容分為兩部分進(jìn)行了論述：
　　第一部分輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定
　　目的：
　　輸卵管組織為臨床婦產(chǎn)科手術(shù)后常見(jiàn)廢棄組織，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞表面標(biāo)志物分析及體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證明輸卵管組織中存在間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，并通過(guò)體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證明輸卵管干細(xì)胞的多向分化潛能。
　　方法：
　　1、收取2013年6月至9月就診于北京海軍總醫(yī)院手術(shù)治療的6例患者的輸卵管組織，6例患者因子宮肌

2、瘤、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌及卵巢癌等疾病行輸卵管組織切除術(shù)。
　　2、利用體外胰酶消化法將輸卵管組織進(jìn)行消化，然后行細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞傳代。
　　3、將P3代細(xì)胞行流式細(xì)胞學(xué)鑒定，鑒定所用抗體為:CD13-FITC，CD29-APC，CD44-APC，CD90-FITC，CD14-APC，CD19-APC，CD34-PE,CD45-FITC，CD73-PE，CD105-PercP，CD166-PE，HLA-DR-APC,HLA-A

3、BC-FITC。
　　4、取P3代輸卵管細(xì)胞在體外通過(guò)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基而向骨、脂肪及軟骨方向進(jìn)行誘導(dǎo)分化，并將誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞行RT-PCR鑒定。成脂分化引物:PPAR-γ2和AP2;成骨分化引物:Osteocalcin、Osteopontin和ALP;成軟骨分化引物:Sox-9和COMP。
　　結(jié)果：
　　1、本實(shí)驗(yàn)中輸卵管中培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞符合2006年美國(guó)國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)所提出的關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，所以本實(shí)驗(yàn)

4、證明了輸卵管組織分離培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2、輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞在體外具有向骨、脂肪及軟骨多向分化的潛能。
　　結(jié)論：
　　輸卵管組織是婦產(chǎn)科手術(shù)后常見(jiàn)的臨床廢棄組織，根據(jù)2006年美國(guó)國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)提出的間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn):1.細(xì)胞為貼壁細(xì)胞。2.流式細(xì)胞結(jié)果必須≥95％的MSCs表達(dá)CD105、CD90和CD73，同時(shí)必須滿(mǎn)足≤2％的MSCs表達(dá)CD34、CD45、CD14、CD11b、CD79

5、α、CD19和HLA-Ⅱ。3.細(xì)胞在體外具有向骨、脂肪及軟骨分化的能力。本實(shí)驗(yàn)中輸卵管細(xì)胞在培養(yǎng)48小時(shí)后貼壁，經(jīng)流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示:輸卵管細(xì)胞均陽(yáng)性表達(dá)CD73、CD105和CD90，同時(shí)輸卵管細(xì)胞在體外具備向成骨、軟骨及脂肪分化能力。所以，輸卵管組織中存在間充質(zhì)干細(xì)胞，也間接說(shuō)明了輸卵管組織是間充質(zhì)干細(xì)胞的又一新來(lái)源，體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)也證明了輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞具有向骨、脂肪與軟骨分化的潛能，可以為輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞治療相關(guān)方面的疾

6、病提供依據(jù)。
　　第二部分輸卵管與輸卵管內(nèi)膜干細(xì)胞的比較研究
　　目的：
　　體外分離培養(yǎng)及鑒定輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞。并從細(xì)胞形態(tài)、表型、增殖分化及體外因子分泌等方面將輸卵管與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行比較研究，并從生物學(xué)特性和治療潛能角度來(lái)評(píng)估他們對(duì)于組織損傷修復(fù)的潛能。
　　方法：
　　1、取同一患者的輸卵管組織（左側(cè)）和輸卵管內(nèi)膜組織（右側(cè)），患者年齡為35-55歲之間，6例患者因子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜

7、癌、子宮頸癌及卵巢癌等疾病行輸卵管組織切除術(shù)。
　　2、將輸卵管與輸卵管內(nèi)膜組織在體外用胰酶+膠原酶Ⅰ消化法將組織消化成細(xì)胞，然后行細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞傳代。
　　3、取P3代輸卵管與輸卵管內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析來(lái)鑒定細(xì)胞表面分子標(biāo)志物，所用抗體:CD13-FITC，CD29-APC，CD44-PE，CD90-FITC，CD14-APC，CD19-APC，CD34-PE，CD45-FITC，CD73-PE，CD105-Perc

8、P,CD166-PE，HLA-DR-APC，HLA-ABC-FITC。
　　4、用克隆形成率與CCK-8兩種方法來(lái)比較P3代輸卵管與輸卵管內(nèi)膜細(xì)胞的增殖能力。
　　5、體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn):將P3代輸卵管與輸卵管內(nèi)膜細(xì)胞在體外經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)后向骨、脂肪及軟骨方向誘導(dǎo)分化。
　　6、將輸卵管與輸卵管內(nèi)膜細(xì)胞誘導(dǎo)分化為骨、脂肪及軟骨后，通過(guò)RT-PCR方法比較兩者誘導(dǎo)分化后與骨、脂肪及軟骨相關(guān)基因表達(dá)水平，從而比較兩者的

9、誘導(dǎo)分化潛能。
　　7、采用ELISA方法來(lái)檢測(cè)P3代輸卵管與輸卵管內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)及免疫因子分泌水平，并將兩者的因子分泌水平進(jìn)行比較。
　　8、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:本實(shí)驗(yàn)所有檢測(cè)樣品均為一式三份。計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩獨(dú)立樣本間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，實(shí)時(shí)RT-PCR數(shù)據(jù)結(jié)果采用2008版本的REST(Relative Expression Software Tool2008)進(jìn)行相對(duì)定量基因表達(dá)分析，按α=0.05檢驗(yàn)水

10、平，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、根據(jù)2006年美國(guó)國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)提出的關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)從輸卵管內(nèi)膜獲取細(xì)胞符合此項(xiàng)鑒定標(biāo)準(zhǔn)。
　　2、流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果:輸卵管與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞均陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)表面分子標(biāo)志物(CD90，CD73，CD105)以及細(xì)胞粘附分子(CD166，HLA-ABC)，均陰性表達(dá)造血干細(xì)胞血表面標(biāo)志物(CD34，CD45，CD14，HLA-

11、DR，CD19)。與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞相比較，輸卵管間充質(zhì)干細(xì)CD44及CD13的表達(dá)顯著增強(qiáng)。
　　3、克隆形成率:與輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞相比較，輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞形成克隆團(tuán)數(shù)量較多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、根據(jù)CCK-8結(jié)果繪制出的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖提示:1、P3代輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期倍增時(shí)間短于輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞。<

12、br>　　5、體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:P3代輸卵管與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞都具有在體外向骨、脂肪及軟骨分化的潛能。
　　6、RT-PCR結(jié)果提示:與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞相比較，輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后，Osteocalcin、Osteoponlin及ALP三種骨相關(guān)基因表達(dá)水平均高于輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞。輸卵管與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成脂及成軟骨誘導(dǎo)分化后，兩者脂肪及軟骨相關(guān)基因表達(dá)水平無(wú)明顯差別。
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13、、體外因子分泌結(jié)果提示:輸卵管與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞在體外均分泌一定量的生長(zhǎng)因子及免疫因子，生長(zhǎng)因子包括:bFGF、EGF、GM-CSF、HGF及VEGF。免疫因子包括:IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-β及IFN-γ。生長(zhǎng)因子檢測(cè)結(jié)果:輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的bFGF、EGF及GM-CSF水平高于輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞，但輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞分泌HGF與VEGF水平較高。免疫因子檢測(cè)結(jié)果:輸卵管內(nèi)膜干細(xì)胞相對(duì)分泌較高水平免疫因子

14、IL-4，TNF-α和TNF-β。但是輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞相對(duì)分泌較高水平的IFN-γ。IL-6分泌水平在兩者之間并沒(méi)有明顯差距。IL-2與IL-10均因濃度太低未能檢測(cè)。
　　結(jié)論：
　　1、本實(shí)驗(yàn)證實(shí)輸卵管內(nèi)膜中存在間充質(zhì)干細(xì)胞。我們將其命名為輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2、與輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞相比較，輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖能力及較短的倍增時(shí)間，增殖能力是評(píng)估干細(xì)胞治療潛能的重要指標(biāo)，提示輸卵管內(nèi)膜

15、間充質(zhì)干細(xì)胞具有更大的治療前景。
　　3、經(jīng)體外誘導(dǎo)及RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出極強(qiáng)的成骨能力，與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞相比較，輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞在治療骨相關(guān)疾病可能表現(xiàn)出較強(qiáng)優(yōu)勢(shì)。
　　4、輸卵管內(nèi)膜干細(xì)胞分泌較高水平的bFGF，EGF及GM-CSF，bFGF和EGF均參與上皮損傷后修復(fù)過(guò)程，在上皮修復(fù)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。并且bFGF和EGF均可以加速傷口愈合減少疤痕形成。
　　5、與輸

16、卵管間充質(zhì)干細(xì)胞相比較，輸卵管內(nèi)膜干細(xì)胞分泌更較高水平的抗炎癥因子IL-4、GM-CSF及較低水平的促炎因子IFN-γ，說(shuō)明輸卵管內(nèi)膜干細(xì)胞具有抗炎癥反應(yīng)作用，因此在慢性炎癥損傷中，輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞可以加速愈合速度，快速度過(guò)慢性炎癥期。
　　6、與輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞相比較，輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖能力及因子分泌水平。經(jīng)體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究可以認(rèn)為對(duì)于組織損傷修復(fù)，與輸卵管間充質(zhì)干細(xì)胞相比較，輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞更