核膜BK通道調(diào)節(jié)神經(jīng)元核鈣依賴性的基因表達及樹突分支.pdf

1、本文深入探討了在神經(jīng)元興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)過程中，細胞核膜BK通道對于調(diào)節(jié)神經(jīng)活動依賴性的基因表達的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元核膜BK通道通過影響細胞核周隙的鈣離子釋放，調(diào)節(jié)CaMKⅣ依賴性的細胞核鈣離子信號通路，進而調(diào)控神經(jīng)元活動誘導的CREB轉(zhuǎn)錄因子的活化，以及下游靶基因的表達，并且影響了神經(jīng)元樹突分支。
　　1.核膜BK通道通過CaMKⅣ依賴性的細胞核鈣離子信號通路調(diào)節(jié)CREB的磷酸化。
　　為了進一步證實CaMKⅣ信號通路參

2、與核膜BK通道對CREB磷酸化的調(diào)節(jié)作用，我們分別用CaMKⅣ信號通路的特異性抑制劑STO-609來阻斷CaMKⅣ信號，和ERK信號通路的特異性抑制劑U0126來阻斷ERK信號通路，免疫熒光染色結(jié)果顯示，在分離的功能完整的細胞核上，CaMKⅣ信號通路的阻斷劑STO-609有效地阻斷了paxilline誘導的CREB磷酸化的升高(P=0.007)，而ERK信號通路的阻斷劑U0126沒有影響paxilline對CREB磷酸化的促進作用。這提

3、示CaMKIV信號通路，而非ERK信號通路，介導了核膜BK通道對CREB磷酸化的調(diào)節(jié)作用。
　　除了分離的細胞核外，我們在完整的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上也進行了同樣的實驗。由于在完整細胞上，細胞質(zhì)膜也表達有大量的BK通道，因此為了排除細胞質(zhì)膜上BK通道對實驗結(jié)果造成干擾，所有細胞都用一種BK通道的不能穿透細胞膜的肽類阻斷劑IbTx進行了預處理，阻斷細胞膜上的BK通道而不影響細胞內(nèi)的BK通道，以排除在完整細胞上細胞質(zhì)膜BK通道帶來的影響。S

4、TO-609阻斷了paxilline誘導的CREB磷酸化的升高(P=0.001)，而ERK信號通路的阻斷劑U0126沒有影響這一作用。這些結(jié)果證實了核膜BK通道是通過CaMKⅣ信號通路而非ERK信號通路來調(diào)節(jié)CREB轉(zhuǎn)錄活性。
　　通過對培養(yǎng)神經(jīng)元外源表達shRNA來降低CaMKⅣ表達，我們進一步驗證了阻斷CaMKⅣ信號通路產(chǎn)生的作用。同樣的，在降低CaMKⅣ表達以后，paxilline不能顯著提高CREB磷酸化程度(P=0.79

5、2)，進一步證明CaMKIV介導了核膜BK通道對CREB磷酸化的調(diào)節(jié)作用。此外，我們通過另外兩種方式抑制CaMKⅣ依賴性的細胞核鈣信號通路，一種是外源表達一種定位于細胞核的并且能夠螯合鈣離子的蛋白質(zhì)PV-NLS(帶有核定位序列的parvalbumin)來緩沖細胞核內(nèi)的鈣濃度升高;另一種是外源表達一種CaMKⅣ的突變體dnCaMKⅣK75E，這個突變體已經(jīng)失去了它的酶活性，因此是CaMKⅣ的一種顯性負性形式，能夠競爭性抑制內(nèi)源性CaMKⅣ

6、的作用。同樣地，在外源表達了PV-NLS或者dnCaMKⅣK75E的細胞，paxilline對CREB磷酸化的調(diào)節(jié)作用減弱了(PV-NLS與dnCaMKⅣK75E組均為P=0.000)。
　　以上證據(jù)表明，核膜BK通道通過調(diào)節(jié)核鈣濃度，以及CaMKⅣ依賴的核鈣信號通路，調(diào)控CREB的磷酸化。
　　2.核膜BK通道參與調(diào)控神經(jīng)元活動誘導的CREB轉(zhuǎn)錄因子活化與基因表達。
　　我們首先在培養(yǎng)神經(jīng)元上使用IbTx封閉細胞膜上

7、的BK通道，以排除細胞膜BK通道可能帶來的影響后，我們使用GABA受體阻斷劑Bicuculine阻斷GABA系統(tǒng)對神經(jīng)元的抑制作用，通過這種手段提高錐體神經(jīng)元的興奮活動。bicuculine的處理可以誘導神經(jīng)元細胞核內(nèi)鈣離子濃度上升，我們通過免疫熒光染色檢測到CREB磷酸化也得到增強(P=0.005)。但是經(jīng)過paxilline預處理過的神經(jīng)元在接受bicuculine處理后，細胞核鈣信號變化以及CREB活性增加幅度都有減弱(P=0.0

8、27)。這可能是由于神經(jīng)活動引發(fā)的細胞核鈣信號增強依賴于細胞核周隙鈣庫的充盈，而paxilline預處理促使細胞核周隙的鈣離子排出，減少了核周隙鈣庫中的鈣離子，因此減弱了bucuculine引發(fā)的細胞核鈣信號。這些實驗數(shù)據(jù)說明核膜的BK通道能夠調(diào)節(jié)興奮活動引起的細胞核鈣信號活動以及CREB磷酸化。為了排除paxilline的作用是由于非特異性地結(jié)合了BK通道以外的其它靶點的可能性，我們在BK基因敲除小鼠(Kcnma1-/-)培養(yǎng)的海馬神

9、經(jīng)元上做了相同的實驗，我們沒有檢測到paxilline對bicuculine誘導的細胞核鈣信號改變有任何影響，也沒有檢測到paxilline對bicuculine引起的CREB磷酸化產(chǎn)生抑制作用(P=0.623)，這些結(jié)果表明paxilline的作用是特異性作用于BK離子通道的。
　　為了探討核膜BK通道是否參與對調(diào)節(jié)細胞核內(nèi)鈣信號依賴的基因表達的調(diào)節(jié)，我們選取了一系列對細胞核鈣信號敏感的基因作為檢測指標。所有神經(jīng)元用IbTx預處

10、理以排除細胞質(zhì)膜BK通道的影響后，一部分用paxilline阻斷核膜BK通道，另一部分作為對照，然后通過qPCR檢測這些基因的mRNA水平，觀察它們的表達是否受影響，以判斷核膜BK通道是否有可能參與調(diào)節(jié)細胞核鈣信號敏感的基因表達。在基礎神經(jīng)活動水平下，paxilline確實能夠增強Fos(P=0.005),Npas4(P=0.000),Atf3(P=0.000),Btg2(P=0.007),Bcl6(P=0.000)，以及Ifi206b

11、(P=0.005)等一些神經(jīng)活動依賴性基因的表達。Paxilline對神經(jīng)元基因表達的促進的作用可以被CaMKⅣ信號通路特異性阻斷劑STO-609徹底阻斷(Fos，P=0.001;Npas4，P=0.001;Atf3，P=0.001;Btg2，P=0.048; Bcl6，P=0.003; Ifi206b，P=0.015)。為了更進一步驗證核膜BK通道對基因表達的作用，排除paxilline可能存在的非特異性影響，我們同樣在Kcnma-/

12、-小鼠的神經(jīng)元上檢測了paxilline是否還能夠引起這些活動依賴性基因的表達。我們的實驗結(jié)果顯示在沒有BK通道的神經(jīng)元，paxilline不能引起這些基因表達的改變(Fos，P=0.896; Npas4，P=0.990; Atf3，P=0.896; Btg2，P=0.856;Bcl6，P=0.929; Ifi206b，P=0.929)，排除了paxilline非特異性的可能。
　　綜合這些結(jié)果，我們認為在神經(jīng)元興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)過程

13、中，核膜BK通道對神經(jīng)活動引起的核鈣信號活動、CREB轉(zhuǎn)錄因子的激活，以及下游敏感基因的表達都具有重要的調(diào)控作用。
　　3.核膜BK通道通過CaMKⅣ依賴性的核鈣信號通路和CREB介導的基因表達，調(diào)節(jié)神經(jīng)元樹突分支。
　　為了闡明核膜BK通道是否通過調(diào)控其下游基因的表達來調(diào)節(jié)樹突分支，我們首先在核膜BK通道調(diào)控的基因中篩選了可能參與調(diào)節(jié)樹突分支的基因。我們分別設計了一系列shRNA來干擾Fos，Npas4，Atf3，Btg2

14、，Bcl6，以及Ifi206b這些核膜BK通道的下游基因的表達，并通過sholl分析方法檢測神經(jīng)元樹突分支的復雜程度，檢測樹突總長度。我們的數(shù)據(jù)表明，在這六個下游基因當中，抑制Fos，Atf3，Btg2，Bcl6，以及Ifi206b的表達都沒有影響樹突分支復雜程度或者總長度，而當Npas4基因的表達被干擾，樹突分支的復雜程度顯著降低，樹突總長度也下降(P=0.008)。這提示在核膜BK通道調(diào)控的下游基因中，Npas4可能介導了核膜BK通

15、道對樹突分支的影響。為了進一步證明核膜BK通道是通過Npas4來調(diào)節(jié)神經(jīng)元的樹突分支的，我們給培養(yǎng)神經(jīng)元用IbTx預處理后，給予paxilline抑制核膜BK通道，并用上述shRNA干擾Fos，Npas4，Atf3，Btg2，Bcl6，以及Ifi206b的表達，我們發(fā)現(xiàn)只有當Npas4基因的表達被抑制，paxilline誘導的樹突分支的復雜程度及樹突總長的的增加被逆轉(zhuǎn)(P=0.000)，而干擾其他基因表達均沒有對paxilline的作用

16、產(chǎn)生影響。這些結(jié)果說明，核膜BK通道是通過抑制Npas4基因的表達來調(diào)節(jié)神經(jīng)元的樹突分支的。
　　上述結(jié)果表明，核膜BK通道的一個生理功能是將神經(jīng)元的突觸活動與細胞核鈣信號耦聯(lián)起來，進而調(diào)節(jié)突觸信號從神經(jīng)元樹突向細胞核內(nèi)的傳遞過程。我們的研究揭示核膜BK通道是細胞核膜上調(diào)節(jié)神經(jīng)活動依賴性核鈣信號的一個新的調(diào)節(jié)因子。
　　以上實驗數(shù)據(jù)用(X)±SD進行描述，統(tǒng)計分析采用獨立樣本t檢驗及One-wayANOVA，實驗數(shù)據(jù)分為兩個