海馬神經(jīng)元Kv7通道的活動(dòng)依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及其在急性應(yīng)激所致記憶損傷中的作用研究.pdf

1、第一部分：海馬神經(jīng)元Kv7通道活動(dòng)依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)及機(jī)制研究
　　目的：研究海馬神經(jīng)元Kv7通道活動(dòng)依賴性的轉(zhuǎn)運(yùn)及其機(jī)制。
　　方法：原代海馬神經(jīng)元（E18）體外培養(yǎng)第11-14天進(jìn)行藥物處理，水迷宮空間學(xué)習(xí)訓(xùn)練模擬海馬細(xì)胞興奮模型。Western blot方法檢測(cè)Kv7.2和Kv7.3總蛋白與細(xì)胞質(zhì)膜蛋白的變化情況,全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄M電流變化情況，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察Kv7通道亞基蛋白在細(xì)胞上的分布變化情況。
　　結(jié)果

2、：（1）谷氨酸(10μM，10 min)誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元興奮后Kv7.2和Kv7.3總蛋白的表達(dá)沒有變化，但是細(xì)胞質(zhì)膜上的Kv7.2和Kv7.3表達(dá)水平以及M電流的幅度均降低，并且細(xì)胞質(zhì)膜上的Kv7.2和Kv7.3在谷氨酸興奮神經(jīng)元4 h后恢復(fù)到正常水平；（2）NMDA（20μM，10 min）和AMPA（100μM，15 min）誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元興奮后，細(xì)胞質(zhì)膜上的Kv7.2、Kv7.3蛋白水平和M電流的幅度均降低，NMDA受體拮抗劑D,

3、L-APV（100μM，15 min）和AMPA-KA受體拮抗劑CNQX（100μM，15 min）可阻斷谷氨酸介導(dǎo)細(xì)胞膜表面Kv7通道的表達(dá)下調(diào)和M電流幅度降低；（3）胞外鈣離子螯合劑EGTA（5 mM，15 min）、胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM（10μM，20 min)、電壓依賴性鈣離子通道阻斷劑CdCl2(200μM，15 min)和L-型鈣離子通道阻斷劑（nifedipine；10μM，15 min）均可抑制谷氨酸介導(dǎo)的細(xì)

4、胞膜表面Kv7通道的表達(dá)下調(diào)和M電流幅度降低；（4）PKA激動(dòng)劑forskolin(10μM，20 min)和PKC激動(dòng)劑PMA（1μM，30 min）對(duì)Kv7.2和Kv7.3總蛋白表達(dá)沒有影響，但是激活PKC可導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜上Kv7.2和Kv7.3水平降低，并且PKC拮抗劑BIS I（1μM，30 min）可抑谷氨酸介導(dǎo)的細(xì)胞膜表面Kv7通道的表達(dá)下調(diào)和M電流幅度降低；（5）激活突觸NMDA受體誘導(dǎo)的化學(xué)性LTP伴隨著細(xì)胞膜表面Kv7.

5、2和Kv7.3水平降低的現(xiàn)象；（6）海馬依賴性學(xué)習(xí)訓(xùn)練模型大鼠海馬中細(xì)胞膜表面Kv7.2和Kv7.3蛋白水平明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：離子型谷氨酸受體介導(dǎo)海馬神經(jīng)元Kv7通道活動(dòng)依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)，鈣離子和PKC的激活參與了此轉(zhuǎn)運(yùn)過程，此信號(hào)通道可能是調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元興奮性和突觸可塑性重要的分子機(jī)制。
　　第二部分：Kv7通道在急性應(yīng)激所致記憶損傷中的作用研究
　　目的：研究Kv7通道在急性應(yīng)激所致記憶損傷中的作用。
　　方法

6、：SD雄性大鼠隨機(jī)分為：正常組（0.9％生理鹽水），溶劑組（0.3%DMSO），正常給藥組（5 mg/kg flupirtine，8 mg/kg retigabine），模型組，模型+溶劑組（0.3%DMSO），模型+激動(dòng)劑給藥組（5 mg/kg flupirtine，8 mg/kg retigabine），模型+激動(dòng)劑+拮抗劑給藥組（5 mg/kg flupirtine+0.3 mg/kg XE-991）。將大鼠放置在位于明亮空間中央

7、的一個(gè)不穩(wěn)定高臺(tái)上持續(xù)30 min制作高臺(tái)恐懼急性應(yīng)激模型。Western blotting方法檢測(cè)蛋白表達(dá)，水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物的空間記憶能力，在體場(chǎng)電位方法記錄海馬CA1區(qū)興奮性突觸后電位（fEPSP）。
　　結(jié)果：（1）急性應(yīng)激大鼠海馬中Kv7.2和Kv7.3表達(dá)水平明顯下調(diào)；（2）急性應(yīng)激損傷大鼠的空間記憶和海馬LTP；（3） Kv7通道激動(dòng)劑-氟吡汀（flupirtine，5 mg/kg）或瑞替加濱（8 mg/kg）能夠有

8、效減輕急性應(yīng)激所致的空間記憶障礙和海馬LTP受損，并且flupirtine的保護(hù)作用能夠被Kv7通道特異性阻斷劑XE-991（0.3 mg/kg）阻斷；（4）急性應(yīng)激大鼠海馬中p-Ser9-GSK-3β表達(dá)明顯降低；（5）flupirtine（5 mg/kg）或 retigabine（8 mg/kg）能夠逆轉(zhuǎn)急性應(yīng)激所致的p-Ser9-GSK-3β表達(dá)降低，XE-991（0.3 mg/kg）能夠拮抗flupirtine（5 mg/kg）

9、的作用；（6）急性應(yīng)激大鼠海馬中β-catenin水平明顯下調(diào)，flupirtine（5 mg/kg）或 retigabine（8 mg/kg）能夠抑制急性應(yīng)激所致的β-catenin水平下降，XE-991（0.3 mg/kg）能夠拮抗flupirtine（5 mg/kg）的作用；
　　結(jié)論：急性應(yīng)激損傷導(dǎo)致海馬神經(jīng)元Kv7通道蛋白表達(dá)降低，Kv7通道激活劑flupirtine和retigabine能夠改善急性應(yīng)激所致的空間記憶障