火器性周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)元凋亡的特點及CIDE-B基因?qū)ι窠?jīng)元凋亡的影響.pdf

1、無論戰(zhàn)時還是平時,火器性周圍神經(jīng)損傷都很常見.近年來盡管在神經(jīng)修復(fù)方面取得長足的進展,但是神經(jīng)損傷仍是困擾骨科的一個難題,神經(jīng)修復(fù)后功能不能完全恢復(fù),甚至有時效果并不理想,造成殘疾.近年來的研究揭示,周圍神經(jīng)損傷后,相應(yīng)中樞神經(jīng)元發(fā)生程度不同的凋亡,與年齡、損傷部位的高低、致傷物的性質(zhì),損傷的能量高低有密切的關(guān)系.火器性周圍神經(jīng)損傷,神經(jīng)元的凋亡程度更重,細(xì)胞數(shù)量減少更多.這是火器性周圍神經(jīng)損傷的功能恢復(fù)不理想的重要原因之一.凋亡(ap

2、optosis)是細(xì)胞啟動內(nèi)在的程序,通過嚴(yán)密精確調(diào)節(jié)的蛋白級聯(lián)水解方式最終引起細(xì)胞死亡的一種方式,在機體發(fā)育過程,抵御外來微生物,消除有害突變以及維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面起重要作用.CIDE-B(Cell death-inducing DFF45-like effector ,CIDE)是凋亡信號通路中新近發(fā)現(xiàn)的促進凋亡的基因,在細(xì)胞凋亡中有重要的作用.神經(jīng)元是高度分化的細(xì)胞,凋亡后胞體不能再生;周圍神經(jīng)只是神經(jīng)元胞體的一部分,神經(jīng)元的

3、凋亡,喪失神經(jīng)軸突再生的基礎(chǔ).如何減少神經(jīng)元的凋亡,保護更多神經(jīng)元免于凋亡,在外傷性周圍神經(jīng)修復(fù)方面具有重要的意義.對神經(jīng)元保護,以往多集中在神經(jīng)營養(yǎng)因子上,包括采用神經(jīng)生長因子載體的基因治療方法.而凋亡相關(guān)基因直接關(guān)乎神經(jīng)元的凋亡,采用基因治療的方法來抑制凋亡基因,以達到保護神經(jīng)元的研究,國內(nèi)外文獻報道較少.如能抑制CIDE-B基因的表達,到達緩解或減輕神經(jīng)元的凋亡,起到保護神經(jīng)元的目的,則對神經(jīng)修復(fù)后的功能恢復(fù)有極其重要的意義.為此

4、,我們從以下方面進行了研究:1.火器性坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)元凋亡的特點 探討在火器性與切割性坐骨神經(jīng)損傷兩種不同致傷條件下,相應(yīng)中樞神經(jīng)元發(fā)生凋亡的不同特點,為對火器性周圍神經(jīng)損傷尋求一種新的治療途徑或思路.2.不同損傷條件下CIDE-B的變化與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系 初步探討上述兩種不同致傷條件下對CIDE-B表達的影響,及其與神經(jīng)元凋亡之間的關(guān)系.3.CIDE-B的變化對神經(jīng)元凋亡調(diào)控的體外研究 體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞,通過干預(yù)其表達,了解

5、其對相應(yīng)神經(jīng)元凋亡的影響.方法:1. 建立火器性坐骨神經(jīng)斷裂傷模型.以三角形彈片為致傷物,造成兔坐骨神經(jīng)斷裂傷模型,通過組織學(xué),DNA凝膠電泳,TUNEL等方法,翔實地研究比較不同損傷神經(jīng)元的凋亡規(guī)律.2. 提取脊髓總RNA,采用RT-PCR的方法檢測CIDE-B的表達變化趨勢.3. 采用原位雜交的方法分析脊髓神經(jīng)元內(nèi)CIDE-B的分布特征,變化規(guī)律.4. 提取脊髓總蛋白質(zhì),采用Western blotting方法研究蛋白的變化規(guī)律,揭

6、示神經(jīng)元凋亡與CIDE-B之間的內(nèi)在聯(lián)系.5. 建立原代脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)模型,采用機械損傷的方法誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡.設(shè)計18bpCIDE-B反義核酸,阻斷神經(jīng)元內(nèi)mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯,通過流式細(xì)胞儀,臺盼藍活細(xì)胞拒染,TUNEL法,觀察神經(jīng)元凋亡情況.結(jié)果:1. 火器性坐骨神經(jīng)斷裂傷后,兔脊髓神經(jīng)元發(fā)生明顯的凋亡.損傷后6h后開始出現(xiàn),1d、3d增加,7d達到凋亡高峰,持續(xù)到傷后2w開始下降,4w明顯減少.神經(jīng)切割傷組凋亡的時間出現(xiàn)較晚,數(shù)

7、量較少.2. 火器性損傷神經(jīng)損傷后,脊髓前角神經(jīng)元的數(shù)量減少,2w、4w減少約11.2﹪,28.6﹪;切割傷組,傷后2w、4w時,脊髓前角神經(jīng)元減少3.6﹪,11.8﹪.3. 在神經(jīng)損傷后脊髓內(nèi),CIDE-B mRNA表達增強.火器性損傷組,增加的強度幅度較大,第1d開始增加,7d到達峰值,持續(xù)到2w,4w回落;切割傷組表達增加延遲,幅度也小.蛋白水平的變化與此相一致.4. 脊髓原代神經(jīng)元培養(yǎng),經(jīng)過NF200kDa抗體鑒定,純度越為80

8、﹪.采用劃痕法機械損傷誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,損傷后3d約有30﹪神經(jīng)元發(fā)生凋亡.5. 體外神經(jīng)元培養(yǎng)凋亡模型下,加入CIDE-B反義核酸,神經(jīng)元凋亡數(shù)量下降到10﹪.而正義、隨機核酸序列對神經(jīng)元的凋亡沒有明顯的影響.結(jié)論:1. 凋亡特點火器性坐骨神經(jīng)斷裂傷后,脊髓神經(jīng)元凋亡較震蕩傷、切割傷嚴(yán)重,呈現(xiàn)發(fā)生早,持續(xù)時間長,神經(jīng)元數(shù)量減少明顯的特點,對神經(jīng)的修復(fù)構(gòu)成重大威脅.2. CIDE-B分布CIDE-B在體內(nèi)的組織分布有組織特異性,主要在肝臟

9、中表達.我們通過RT-PCR,原位雜交,Western blotting的方法首次證實該蛋白在脊髓內(nèi)有明確的表達.3. CIDE-B表達規(guī)律無論火器性損傷還是切割傷,周圍神經(jīng)損傷后脊髓神經(jīng)元CIDE-B在mRNA、蛋白水平的表達均增強,并且在火器性損傷組該基因改變更加明顯.4. 調(diào)節(jié)CIDE-B對神經(jīng)元凋亡的影響以反義核酸抑制CIDE-B的表達,能夠顯著減少損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡.5. CIDE-B與凋亡的關(guān)系周圍神經(jīng)損傷后,脊髓內(nèi)CID