AMPK介導(dǎo)大鼠視皮質(zhì)神經(jīng)元興奮依賴性PGC-1α和NRF-1表達(dá)及線粒體能量代謝調(diào)節(jié).pdf

1、研究背景
　　無論是發(fā)育過程中還是成年后的視皮質(zhì)神經(jīng)元，其結(jié)構(gòu)、功能以及突觸數(shù)量可隨環(huán)境發(fā)生變化，具有經(jīng)驗(yàn)依賴的可塑性(Experience-dependentPlasticity)。新近研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元興奮依賴性(Activity-dependent)調(diào)節(jié)和功能的可塑性與神經(jīng)元能量代謝緊密偶聯(lián)(Energymetaboliccoupling)，這被認(rèn)為是神經(jīng)元可塑性的核心環(huán)節(jié)。神經(jīng)元興奮性(Neuronalactivity)高度

2、依賴于線粒體氧化磷酸化(Oxdatvephosphorylationsystem,OXPHOS)產(chǎn)生的三磷酸腺苷(Adenosinetriphosphate,ATP)。線粒體功能障礙(Mitochodrialdysfunction)可能是視覺剝奪導(dǎo)致視皮質(zhì)神經(jīng)元功能抑制的關(guān)鍵因素。但是，迄今對視皮質(zhì)神經(jīng)元興奮能量偶聯(lián)的信號機(jī)制尚不明確。
　　核呼吸因子(Nuclearrespiratoryfactors,NRFs)是調(diào)節(jié)線粒體氧化

3、磷酸化和線粒體再生的重要轉(zhuǎn)錄因子,通過直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控細(xì)胞核DNA(nDNA)編碼的呼吸酶鏈亞單位基因，并通過線粒體轉(zhuǎn)錄因子A和B(mtTFA,mtTFB)間接調(diào)控線粒體DNA(mtDNA)編碼的呼吸酶鏈亞單位基因，行使其對線粒體呼吸轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，核呼吸因子1(NRF-1)和2(NRF-2)參與了視皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體能量代謝調(diào)控的偶聯(lián)過程，其轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平與神經(jīng)元興奮性呈正相關(guān)，且與細(xì)胞色素氧化酶(Cytochromecox

4、idase,COX)活性是一致的。另一方面，PGC-1α,即過氧化物酶體增生物激活受體γ(Peroxisomeproliferators-activatedreceptorgamma，PPARγ)共激活因子1α(PPARγcoactivator-1-α,PGC-1α)，作為重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子，是線粒體生物合成過程的關(guān)鍵分子。有研究表明，PGC-1α對NRFs的基因表達(dá)具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)作用，可通過NRFs調(diào)節(jié)OXPHOS成分的協(xié)同表達(dá)。因

5、此，PGC-1α能促進(jìn)NRFs的基因轉(zhuǎn)錄，從而協(xié)調(diào)機(jī)體在不同能量供需狀態(tài)時的線粒體呼吸鏈功能。然而，視皮質(zhì)神經(jīng)元興奮能量偶聯(lián)過程中PGC-1α和NRFs的信號調(diào)控機(jī)制亟待深入。
　　來自動物試驗(yàn)以及臨床觀察的證據(jù)均表明，一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)能量平衡微環(huán)境的關(guān)鍵感應(yīng)及效應(yīng)分子，但AMPK在視皮質(zhì)神經(jīng)元中的作用尚未報(bào)道。AMPK是調(diào)控線粒體功能

6、，調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵分子，與PGC-1α關(guān)系密切；另有證據(jù)顯示，AMPK可能是NRFs信號傳導(dǎo)通路中重要的上游激活分子。因此，AMPK信號通路可能是視皮質(zhì)神經(jīng)元興奮能量偶聯(lián)的關(guān)鍵信號途徑。
　　本課題擬通過對視神經(jīng)元興奮依賴性體內(nèi)和體外動物模型的研究，采用細(xì)胞及分子生物學(xué)方法，探討AMPK，PGC-1α和NRFs信號在視皮質(zhì)神經(jīng)元興奮能量偶聯(lián)中的作用機(jī)制。旨在為闡明AMPK調(diào)控下游靶分子參與視覺系統(tǒng)可塑性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供一些

7、有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以期通過AMPK-NRFs通路為靶點(diǎn)進(jìn)行基因治療從而調(diào)節(jié)視皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞功能，為弱視及其它神經(jīng)發(fā)育功能不良(全)性疾病的防治提供思路。
　　研究目的
　　本研究的目標(biāo)是通過在體和離體實(shí)驗(yàn)研究，明確內(nèi)源性AMPK，PGC-1α和NRF-1在視皮質(zhì)神經(jīng)元興奮依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與能量偶聯(lián)中的作用機(jī)制。包括：
　　1.觀察視皮質(zhì)神經(jīng)元興奮與線粒體功能之間的關(guān)系，明確視皮質(zhì)神經(jīng)元的興奮能量偶聯(lián)，分析AMPK，PGC

8、-1α和NRF-1在偶聯(lián)中的作用。
　　2.證明視覺剝奪引起的視皮質(zhì)神經(jīng)元損害是由于內(nèi)源性AMPK，PGC-1α和NRFs系統(tǒng)活性下降進(jìn)而導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化功能下降所致。
　　3.通過在體實(shí)驗(yàn)研究，明確能否通過調(diào)節(jié)AMPK的活性保護(hù)視覺剝奪后線粒體的功能，改善視皮質(zhì)神經(jīng)元的能量代謝狀態(tài)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1．體外培養(yǎng)大鼠視皮質(zhì)神經(jīng)元，采用KCl誘導(dǎo)神經(jīng)元去極化興奮，可興奮依賴性上調(diào)神經(jīng)元PGC-1α，NRF-

9、1及mtTFA的mRNA和蛋白表達(dá)水平；并且，同時增強(qiáng)線粒體產(chǎn)生ATP的能力。
　　2．視皮質(zhì)神經(jīng)元興奮顯著提高細(xì)胞內(nèi)AMPK及其下游激酶ACC的磷酸化水平，提示神經(jīng)元興奮可以激活A(yù)MPK激酶活性。
　　3．另一方面，AMPK抑制劑CompoundC可以有效阻斷視皮質(zhì)神經(jīng)元興奮依賴性的PGC-1α，NRF-1，mtTFA的表達(dá)水平以及ATP含量。
　　4．與之對應(yīng)，AMPK的激動劑，白藜蘆醇(Resveratrol)或

10、AICAR，可顯著增加視皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)ATP水平，并上調(diào)PGC-1α，NRF-1，mtTFA的表達(dá)水平。該作用可被CompoundC所阻斷。
　　5．采用大鼠單眼視覺剝奪(Monoculardeprivation,MD)在體模型研究發(fā)現(xiàn)，視覺剝奪顯著損害對應(yīng)的視皮質(zhì)神經(jīng)元：導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體腫脹，數(shù)量減少；神經(jīng)元內(nèi)ATP水平顯著降低。
　　6．定量檢測發(fā)現(xiàn)，視覺剝奪顯著抑制了對應(yīng)的視皮質(zhì)神經(jīng)元AMPK的激酶活性和磷酸化水平；PG

11、C-1α和NRF-1的表達(dá)水平也隨之降低。
　　7．更為重要的是，在體給予Resveratrol治療顯著增加神經(jīng)元線粒體數(shù)量，改善線粒體形態(tài)；增加神經(jīng)元內(nèi)ATP水平；激活A(yù)MPK活性，上調(diào)PGC-1α和NRF-1的表達(dá)，從而可以有效抑制視覺剝奪導(dǎo)致的視皮質(zhì)神經(jīng)元損害。
　　結(jié)論
　　1．視皮質(zhì)神經(jīng)元興奮與能量調(diào)節(jié)緊密偶聯(lián)，而AMPK是興奮能量偶聯(lián)的關(guān)鍵分子。
　　2．AMPK介導(dǎo)視皮質(zhì)神經(jīng)元PGC-1α，NRF-