PND小鼠結腸傳輸功能、直腸敏感性和遠端結腸感覺信號分子表達變化.pdf

1、盆腔神經(jīng)損傷引起的結直腸動力障礙在結直腸外科很常見，常會引起腹部脹痛、頑固性便秘、排糞不盡、直腸墜脹等臨床表現(xiàn)，嚴重影響患者的生活質量，臨床處理困難。在直腸癌手術中，有多個容易造成自主神經(jīng)損傷的危險區(qū)。有研究顯示，中低位直腸癌根治術中游離直腸造成支配直腸的盆腔自主神經(jīng)損傷引起術后排便功能障礙的發(fā)生率高達71％。臨床上觀察到，部分排便功能障礙的患者其癥狀隨時間推移呈緩慢恢復趨勢，說明機體存在適應性恢復的機制，探討盆腔神經(jīng)損傷后的這一適應性

2、恢復的機制對臨床防治有重要價值。
　　研究發(fā)現(xiàn)，去盆腔神經(jīng)支配(pelvic nerve denervation，PND)大鼠的結腸傳輸功能約1周可恢復。前期研究發(fā)現(xiàn)PND大鼠模型結腸黏膜瞬時受體電位通道錨蛋白亞家族成員1（transient receptor potential ankyrin1，TRPA1）蛋白水平顯著降低，但是隨著時間的推移，呈現(xiàn)恢復的趨勢，而且結腸傳輸功能的恢復與其結腸粘膜TRPA1的表達水平有相關性。提示

3、TRPA1可能參與了PND大鼠結腸動力的適應性恢復過程。
　　TRPA1是表達于腸嗜鉻(enterochromaffin，EC)細胞的感受器分子，能夠感知腸腔內化學與物理的刺激信號，并介導EC細胞釋放5-HT調控腸動力。而在眾多的5-HT受體中，5-HT3及5-HT4受體在腸粘膜感覺神經(jīng)調控中的作用最受關注。本研究擬建立PND小鼠模型，利用TRPA1基因敲除小鼠深入研究TRPA1在PND小鼠腸動力適應性恢復過程中的作用，并觀察下游

4、的5-HT3及5-HT4受體蛋白表達水平的變化，初步了解TRPA1的作用機制。
　　目的:
　　1、建立去盆腔神經(jīng)支配(PND)小鼠模型。
　　2、了解PND小鼠遠端結腸TRPA1蛋白的表達變化。
　　3、利用TRPA1基因敲除小鼠，探討TRPA1在PND小鼠結腸動力變化中的作用機制。
　　方法:
　　一、實驗對象和分組
　　1、將108只成年雄性C57小鼠隨機分為3部分:結腸傳輸試驗36只，分

5、為PND組和假手術組，各18只。直腸敏感性試驗36只，分為PND組和假手術組，各18只。TRPA1蛋白檢測36只，分為PND組和假手術組，各18只。
　　2、用18只野生型小鼠和18只TRPA1基因敲除小鼠建立PND模型，用于觀察遠端結腸5-HT3和5-HT4受體蛋白的表達變化。
　　二、模型制備
　　1、PND模型組:小鼠開腹后分離出雙側盆腔神經(jīng)，顯微剪剪斷。
　　2、假手術組:小鼠開腹后，不剪斷盆腔神經(jīng)。

6、r>　　3、腸傳輸試驗的小鼠，在盲腸埋入硅膠管。直腸敏感性試驗的小鼠，在小鼠腹外斜肌處埋入鉑金電極。
　　三、檢測指標
　　1、結腸傳輸功能檢測:術后（postoperative day，POD）第1、3、7天三個時相點，從預置硅膠管注射亞甲藍注射液，20分鐘后處死小鼠，通過計算各組小鼠結腸組織中亞甲藍分布占結腸組織總長度的百分比（傳輸比例）檢測結腸傳輸功能。
　　2、直腸敏感性檢測:術后第1、3、7天三個時相點，采用

7、結直腸擴張(CRD)-內臟運動反射(VMR)評估各組直腸敏感性的改變。
　　3、Western Blot檢測:術后第1、3、7天三個時相點遠端結腸黏膜中的TRPA1，5-HT3和5-HT4受體蛋白表達情況。
　　結果:
　　1、小鼠PND模型建立情況:雙側盆腔神經(jīng)切斷后均會出現(xiàn)尿潴留，需要每日按摩膀胱協(xié)助排尿。結腸傳輸試驗顯示:與假手術組相比，PND模型組小鼠術后第1天與第3天結腸傳輸功能顯著降低(t=10.065，2

8、.986，P＜0.001，P=0.017)，但PND模型組小鼠結腸傳輸功能隨時間推移呈顯著恢復趨勢，術后第7天時與假手術組已無差異(t=0.459，P＞0.05)。內臟敏感性試驗顯示PND模型組小鼠術后第1、3、7天內臟敏感性均顯著降低(t=3.134，2.543，3.357，P=0.011，0.029，0.007)，但隨時間推移也呈恢復趨勢。
　　2、小鼠遠端結腸TRPA1蛋白表達檢測顯示:與假手術組相比，PND模型組小鼠術后第

9、1、3天的結腸遠端TRPA1蛋白表達均顯著降低（均P＜0.01），但PND模型組小鼠結腸遠端TRPA1蛋白表達隨時間推移呈顯著恢復趨勢，術后第7天與假手術組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3、去盆腔神經(jīng)支配后，TRPA1敲除小鼠和野生型小鼠結腸遠端5-HT3和5-HT4受體蛋白表達都呈現(xiàn)隨時間推移而恢復的趨勢。與野生型小鼠相比，TRPA1基因敲除小鼠術后第1天與第3天結腸遠端5-HT3受體蛋白表達明顯降低(P=0.02，0

10、.048)，第7天無統(tǒng)計學意義(P=0.203)。同樣，與野生型小鼠相比，TRPA1基因敲除小鼠術后第1、3、7天結腸遠端5-HT4受體蛋白表達均明顯降低(P＜0.001，P=0.036，0.011)。
　　結論:
　　1、去盆腔神經(jīng)支配后，小鼠結腸傳輸和直腸敏感性減弱，但隨時間推移可逐漸恢復。
　　2、去盆腔神經(jīng)支配后，小鼠遠端結腸TRPA1表達顯著降低，但隨時間推移可逐漸恢復。
　　3、TRPA1基因敲除后，