PTP1B抑制劑通過激活DOCK180-Rac1通路促進內(nèi)皮細胞的運動.pdf

1、研究背景:
　　內(nèi)皮細胞(EC)遷移在血管生物學(xué)中是一項基本的生理過程，在胚胎的生長發(fā)育、血管生成/新生、后天的損傷修復(fù)以及諸多疾病的病理過程中都扮演著重要的角色。促進內(nèi)皮細胞遷移不僅對治療性血管新生非常重要，同時對加速血管損傷后的再內(nèi)皮化和制造有穩(wěn)定功能的人造血管也有至關(guān)重要的作用。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能最重要的因子，在內(nèi)皮細胞的遷移過程中有不可取代的作用。PTP1B是酪氨酸磷酸酶(PTPs)家族的重要成

2、員，也是在內(nèi)皮細胞中高表達的PTP。PTP1B是VEGF信號通路中非常關(guān)鍵的負調(diào)控因子。近期，多項研究表明抑制PTP1B可以增強血管內(nèi)皮生長因子2型受體(VEGR2)的信號傳導(dǎo)，從而促進內(nèi)皮細胞遷移和血管新生。然而，PTP1B的底物非常廣泛。目前，我們還不清楚除了通過影響VEGFR2信號通路，PTP1B抑制劑是否還能通過其他機制影響內(nèi)皮細胞的遷移功能。在本次研究中，我們證實了PTP1B抑制劑可不通過VEGFR2信號通路而直接促進內(nèi)皮細胞

3、的運動的假說。利用人內(nèi)皮細胞做研究對象，我們證實了PTP1B抑制劑可以促進內(nèi)皮細胞的黏附、伸展和遷移，這些作用可以被小G蛋白Rac1的抑制劑阻斷，而RhoA的抑制劑則沒有明顯作用。PTP1B抑制劑顯著增加了p130Cas的磷酸化以及p130Cas，Crk和Dock180之間的結(jié)合作用。然而，PTP1B抑制劑處理后，黏著斑激酶(FAK)，Src，paxillin和Vav2的磷酸化水平卻沒有改變。對DOCK180進行基因沉默后，PTP1B抑

4、制劑對內(nèi)皮細胞運動功能的影響消失，而對Vav2基因沉默后卻沒有上述現(xiàn)象。在VEGFR2抑制劑存在的情況下，PTP1B抑制劑對內(nèi)皮細胞運動功能的促進和對p130Cas/DOCK180的激活作用依然存在。根據(jù)以上結(jié)果，我們認為DOCK180通路的激活是PTP1B抑制劑影響內(nèi)皮細胞運動的另一機制，這一機制并不以VEGFR2通路的激活為必要條件。因為心血管病人體內(nèi)VEGF/VEGFR的功能通常呈現(xiàn)受損狀態(tài)，因此對于這些病人來說，PTP1B抑制劑

5、可能作為一種新的治療藥物用于促進內(nèi)皮細胞的遷移功能。
　　研究目的:
　　1.研究PTP1B抑制劑對內(nèi)皮細胞運動功能的調(diào)控作用。
　　2.明確PTP1B抑制劑對內(nèi)皮細胞運動的作用是否絕對依賴于VEGFR2信號通路的激活。
　　3.探索PTP1B抑制劑調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞運動功能的信號傳導(dǎo)機制。
　　研究方法:
　　1.試劑
　　3-(3，5-二溴-4-羥基苯甲酰)-2-乙基-N-[4-（1，3-噻唑-2

6、-氨磺酰））苯基]-1-苯并呋喃-6-磺酰胺（PTP抑制劑22），Rhosin和NSC23766，PP2，and Ki8751均購自Merck Millipore(Darmstadt，Germany)。TCS401購買自Tocris Bioscience(Bristol, UK)。
　　2.細胞培養(yǎng)
　　人臍靜脈內(nèi)皮(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)及端粒酶-永生化

7、人微血管內(nèi)皮細胞(Telomerase-immortalized HumanMicrovascular Endothelial，TIME)細胞均購買自美國ATCC公司。以完全內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(ECM)，加入5％胎牛血清、內(nèi)皮細胞生長因子(100U/ml)及青鏈霉素（(100μg/ml)，于溫度37℃，CO2濃度5％的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細胞密度達到70％-90％時進行傳代培養(yǎng)，選擇3-6代的HUVECs用于試驗。
　　3.Tran

8、swell細胞遷移試驗
　　Transwell遷移試驗采用Boyden小室法。將細胞消化后重懸于無血清培養(yǎng)基中，計數(shù)并調(diào)整細胞數(shù)目。向上室中加入105個細胞，下室中添加終濃度為1％胎牛血清作為趨化因子。在細胞孵箱中孵育6小時，用冰甲醇固定遷移穿過膜的細胞，之后用結(jié)晶紫染色。顯微鏡下，每孔取5-10個高倍(400X)視野照相并計數(shù)。所有實驗均重復(fù)至少3次，上下小室均加入藥物刺激和對照。
　　4.細胞黏附試驗
　　以含有0

9、.1％DMSO和10μM PTP InhibitorⅩⅫ的無血清培養(yǎng)基對細胞進行預(yù)處理。1小時后，用胰酶消化細胞，離心后將細胞重懸于含有處理因子的培養(yǎng)基中，接種于24孔板。30分鐘后，用PBS沖洗，去除沒有貼壁的細胞。向24孔板中加入冰甲醇固定細胞，固定完成后用1％的結(jié)晶紫染色。高倍鏡下，每孔取5-10個隨機視野拍照，對黏附的細胞進行計數(shù)。
　　5.細胞伸展試驗
　　以含有0.1％DMSO或目的藥物的無血清培養(yǎng)基對細胞進行預(yù)

10、處理1小時。之后將細胞種在Lab-Tek8孔腔室玻片上(8-well Lab-TekⅡchamber slides Thermo Scientific，Waltham, MA，USA)，加入與預(yù)處理相同的刺激，繼續(xù)孵育1小時。1小時后，用4％多聚甲醛固定細胞，然后用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽(購自Cytoskeleton，Denver，CO，USA)和DAPI對細胞進行共染色。染色完成后，在共聚焦顯微鏡(Model LSM710，Zeiss，

11、Jena，Germany)下進行觀察和圖像采集。采用Image-Pro Plus6.0軟件(Media Cybernetics，Rockville，MD，USA)測量細胞的平均面積。每次試驗均截取150-200個來自隨機視野內(nèi)的細胞進行統(tǒng)計分析。此外，為了對細胞的伸展活動進行實時觀測，我們首先將TIME細胞以PTP1B抑制劑或0.1％DMSO的無血清培養(yǎng)基預(yù)處理1小時。之后將細胞消化，重懸于含有上述刺激的無血清培養(yǎng)基中。將細胞種在膠原Ⅰ

12、包被的6孔板中，調(diào)整細胞數(shù)為105/孔。靜置3分鐘使細胞沉降并輕微貼壁，之后將細胞置于裝有佳能數(shù)碼相機的相差光學(xué)顯微鏡(Olympus Lifescience，Tokyo，Japan)下錄像20分鐘。
　　6.細胞活性檢測
　　進行細胞活性檢測時，先將細胞在96孔板中培養(yǎng)至約100％密度，藥物處理后，應(yīng)用CellTiter96 Aqueous kit試劑盒(購自Promega，Madison，WI，USA)，按照其提供的方法

13、進行檢測。
　　研究結(jié)果:
　　1.PTP1B抑制劑增強了內(nèi)皮細胞的黏附和伸展
　　PTP抑制劑22(PTPI22)是一種細胞通透性的選擇性PTP1B抑制劑。首先，我們采用不同濃度的PTPI22處理TIME細胞24或48小時，發(fā)現(xiàn)低于20μM的濃度對細胞是沒有毒性作用的。接下來的實驗，我們選用10μM的濃度作為試驗濃度。PTPI22刺激TIME細胞后，發(fā)現(xiàn)TIME細胞在膠原Ⅰ包被界面的黏附和伸展運動顯著增強。為了連續(xù)觀

14、察細胞的伸展運動，我們在顯微鏡下對PTPI22處理組和對照組細胞伸展運動進行錄像，結(jié)果顯示PTPI22顯著加快了TIME細胞的伸展運動。為了進一步確認PTPI22的作用，我們用HUVECs重復(fù)上述實驗，證實PTPI22同樣也促進了HUVECs的黏附和伸展。我們在沒有膠原包被的界面上重復(fù)上述實驗，結(jié)果顯示PTPI22依然可以促進細胞的伸展和黏附。此外，我們還選取了另一種PTP1B抑制劑TCS401重復(fù)上述實驗，得到了相似的結(jié)果。
　

15、　2.PTP1B抑制劑促進內(nèi)皮細胞遷移
　　我們采用PTPI22和TCS401處理細胞后，以血清為趨化因子，采用Boydenchambers法檢測內(nèi)皮細胞的遷移。結(jié)果證實，兩種藥物都可以促進內(nèi)皮細胞遷移。
　　3.抑制VEGFR2后PTP1B抑制劑的作用依然存在
　　用VEGFR2抑制劑Ki8751(2 nM)預(yù)處理細胞后，VEGF誘導(dǎo)的Erk1/2水平明顯下降，提示Ki8751有效的阻斷了VEGF/VEGFR2通路。

16、Ki8751預(yù)處理明顯抑制了TIME細胞的伸展反應(yīng)，但加入PTPI22后，TIME細胞的伸展反應(yīng)仍然增強。說明PTPI22在VEGFR2信號通路阻斷的情況下依然能夠促進內(nèi)皮細胞的運動。為了進一步證實這一結(jié)論，我們進行Transwell細胞遷移試驗。結(jié)果顯示，Ki8751可以明顯降低內(nèi)皮細胞的遷移能力，但PTPI22處理后內(nèi)皮細胞的遷移依然增強。
　　4.PTP1B抑制劑對內(nèi)皮細胞運動的作用是Rac1依賴的
　　Rac1抑制劑

17、NSC23766(100μM)處理細胞后，顯著降低了內(nèi)皮細胞的伸展面積。同時，Rac1抑制劑能夠消除PTPI22對細胞伸展的促進作用。PTPI22處理TIME細胞后，Rac1活性顯著增強。同時，Ki8751處理阻斷VEGF/VEGFR2通路后，PTPI22依然可以增強Rac1的活性。然而，應(yīng)用另一小G蛋白Rho的抑制劑Rhosin處理細胞后，卻不能消除PTPI22對細胞伸展的促進作用。此外，遷移試驗結(jié)果顯示NSC23766可以消除PTP