二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK通路降低同型半胱氨酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷.pdf

1、目的:
　　作為血管的保護(hù)傘,血管內(nèi)皮細(xì)胞能使組織液和血液通過(guò)它完成物質(zhì)代謝,而且血管內(nèi)皮細(xì)胞也能產(chǎn)生并分泌生物活性物質(zhì)用來(lái)調(diào)節(jié)凝血與抗凝平衡及血壓等特殊功能,進(jìn)而使血液流動(dòng)正常和血管長(zhǎng)期通暢。同型半胱氨酸能夠使心血管疾病的發(fā)病率升高,這跟它誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有關(guān)。作為一種降糖藥物,二甲雙胍被研究發(fā)現(xiàn),可以使乳腺癌與心血管疾病的發(fā)病率降低,本實(shí)驗(yàn)旨在探討二甲雙胍能否降低同型半胱氨酸對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及其可能存在的機(jī)制。

2、>　　方法:
　?、儆^察不同溶度同型半胱氨酸(Hcy)作用血管內(nèi)皮細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞活性的影響將實(shí)驗(yàn)分為正常組、Hcy組,血管內(nèi)皮細(xì)胞接種24小時(shí)后進(jìn)行藥物處理。Hcy組分別用250μM、500μM、1000μM及2000μM溶度的Hcy處理細(xì)胞24小時(shí);用CCK-8試劑盒檢測(cè)Hcy處理后的各組血管內(nèi)皮細(xì)胞活性。
　?、谟^察不同濃度二甲雙胍(Metformin)作用血管內(nèi)皮細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞活性的影響將實(shí)驗(yàn)分為正常組、Merformin

3、組,血管內(nèi)皮細(xì)胞接種24小時(shí)后進(jìn)行藥物處理。Merformin組分別用250μM、500μM、1000μM及2000μM溶度的Merformin處理細(xì)胞24小時(shí);用CCK-8試劑盒檢測(cè)Metformin處理后的各組血管內(nèi)皮細(xì)胞活性。
　　③構(gòu)建 Hcy的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型探討 Merformin的干預(yù)作用及其機(jī)制將實(shí)驗(yàn)分為正常組,Hcy組,Merformin組,Hcy+Merformin組。細(xì)胞接種24小時(shí)后藥物處理。Hcy組加

4、入1000μM溶度的Hcy,Merformin組加入1000μM溶度的Merformin,Hcy+Merformin組同時(shí)加入1000μM溶度的Hcy及1000μM溶度的 Merformin,然后共同作用24小時(shí)。對(duì)各組進(jìn)行以下方面檢測(cè):CCK-8檢測(cè)各組血管內(nèi)皮細(xì)胞活性,測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)、總超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活性和微量丙二醛(MDA)水平,qRT-PCR測(cè)定NADPHmR

5、NA、SODmRNA及CATmRNA的表達(dá),Western Blot測(cè)定p-AMPKα及t-AMPKα蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性
　?、倥c正常組比較,各溶度Hcy組血管內(nèi)皮細(xì)胞活性低(P<0.05),且隨著Hcy濃度的增加,血管內(nèi)皮細(xì)胞活性下降。
　　②與正常組比較,各溶度Merformin組血管內(nèi)皮細(xì)胞活性無(wú)明顯變化(P>0.05),且內(nèi)皮細(xì)胞活性與Merformin濃度無(wú)關(guān)。

6、　　③與正常組比較,Hcy組細(xì)胞活性低(P<0.05),Merformin組對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響(P>0.05),而Hcy+Merformin組較Hcy組細(xì)胞活性高(P<0.05)。
　　(2)乳酸脫氫酶(LDH)活性
　　與正常組比較,Hcy組的細(xì)胞 LDH活性高(P<0.05),Merformin組的細(xì)胞LDH活性無(wú)明顯差異(P>0.05),Hcy+Merformin組LDH活性比Hcy組低(P<0.05), Merfo

7、rmin能降低Hcy導(dǎo)致的LDH活性的升高。
　　(3)細(xì)胞內(nèi)總SOD活性
　　與正常組比較,Hcy組的細(xì)胞總SOD活性低(P<0.05),Merformin組的細(xì)胞總 SOD活性無(wú)明顯差異(P>0.05)。Hcy+Merformin組總 SOD活性比 Hcy組高(P<0.05),Merformin能緩和Hcy導(dǎo)致的總SOD活性的降低。
　　(4)丙二醛(MDA)的生成水平
　　與正常組比較,Hcy組細(xì)胞MDA的

8、生成水平高(P<0.05),Merformin組的細(xì)胞MDA的生成水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。Hcy+Merformin組細(xì)胞MDA的生成水平生成水平比Hcy組低(P<0.05),Merformin能降低Hcy導(dǎo)致的細(xì)胞MDA的增加。
　　(5)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活性
　　與正常組比較,Hcy組的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性低(P<0.05),Merformin組的細(xì)胞谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性無(wú)明顯差異(P>0.

9、05)。Hcy+Merformin組谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性比Hcy組高(P<0.05),Merformin能緩和Hcy導(dǎo)致的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的降低。
　　(6)NADPHmRNA的表達(dá)量
　　與正常組比較, Hcy組的細(xì)胞 NADPHmRNA的表達(dá)量高(P<0.05), Hcy+Merformin組細(xì)胞NADPHmRNA的表達(dá)量比Hcy組低(P<0.05),Merformin能降低Hcy導(dǎo)致的細(xì)胞NADPHmRNA的表

10、達(dá)量的升高。
　　(7)SODmRNA的表達(dá)量
　　與正常組比較, Hcy組的細(xì)胞 SODmRNA的表達(dá)量低(P<0.05), Hcy+Merformin組細(xì)胞SODmRNA的表達(dá)量比Hcy組高(P<0.05),Merformin能緩和Hcy導(dǎo)致的細(xì)胞SODmRNA的表達(dá)量的降低。
　　(8)CATmRNA的表達(dá)量
　　與正常組比較, Hcy組的細(xì)胞 CATmRNA的表達(dá)量低(P<0.05), Hcy+Merfo

11、rmin組細(xì)胞CATmRNA的表達(dá)量比Hcy組高(P<0.05),Merformin能緩和Hcy導(dǎo)致的細(xì)胞CATmRNA的表達(dá)量的降低。
　　(9)p-AMPKα及t-AMPKα蛋白的表達(dá)量。
　　與正常組比較,各實(shí)驗(yàn)組的 t-AMPKα蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05);與正常組比較,Hcy組的p-AMPKα蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05),Merformin組及Hcy+Merformin組的p-AMPKα蛋白的

12、表達(dá)量升高(P<0.05)。Merformin使細(xì)。胞內(nèi)p-AMPKα/t-AMPKα的比值升高,從而使AMPKα的磷酸化水平升高。
　　結(jié)論:
　?、偻桶腚装彼崮苁寡軆?nèi)皮細(xì)胞的活性降低,且隨著同型半胱氨酸的增加,對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性影響越大,其影響內(nèi)皮細(xì)胞活性降低與誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧自由基、MDA、LDH、NADPH等水平或活性上升,而使細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX等活性降低有關(guān)。
　　②Merformi