吳茱萸次堿通過激活CAR調(diào)節(jié)糖脂代謝的機(jī)制及其藥動學(xué)研究.pdf

1、吳茱萸次堿是中藥吳茱萸的主要有效成分之一，已有文獻(xiàn)報道其具有降血糖和降血脂功效。組成型雄甾烷受體(constitutive androstane receptor, CAR)是外源性感受器，除了調(diào)控一相、二相代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)外，在糖脂代謝的調(diào)節(jié)中也有作用，通過前期的文獻(xiàn)查閱和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸次堿可以激活hCAR，對mCAR的靶基因CYP2B10也有誘導(dǎo)作用，提示我們吳茱萸次堿可能對hCAR和mCAR都有激活作用，CAR的激活可能

2、介導(dǎo)了吳茱萸次堿降糖降脂作用。
　　1.吳茱萸次堿調(diào)節(jié)糖脂代謝及對mCAR激活作用的研究
　　為了闡明吳茱萸次堿在糖尿病小鼠模型上的降糖降脂作用以及對mCAR的激活作用，本章研究以DB/DB、OB/OB小鼠和高脂喂食加注射鏈脲佐菌素造模糖尿病小鼠為模型。將每一種糖尿病模型小鼠隨機(jī)分組，分別灌胃給予空白溶劑、苯巴比妥和不同劑量吳茱萸次堿，在給藥過程中記錄小鼠體重和飲食攝入量，給藥一定時間后測定每組小鼠的葡萄糖耐受性和血糖血脂水

3、平，并于給藥結(jié)束后測定肝臟組織中糖異生相關(guān)基因、脂肪生成相關(guān)基因和CYP2B10 mRNA的表達(dá)量。對DB/DB小鼠肝臟組織進(jìn)行石蠟切片，hematoxylin-eosin(H&E)染色，檢測肝臟脂肪變性情況結(jié)果顯示，給予吳茱萸次堿處理后三種糖尿病模型小鼠的葡萄糖耐受性改善，血糖水平都降低，其中，DB/DB和造模糖尿病小鼠中PEPCK和G6pase表達(dá)量下調(diào)，而血脂含量無顯著性變化，SREBP-1，F(xiàn)AS和SCD1的mRNA表達(dá)量也無明

4、顯變化。H&E染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吳茱萸次堿在一定程度上可以緩解DB/DB小鼠肝臟脂肪變性。以上結(jié)果說明吳茱萸次堿可以調(diào)節(jié)糖尿病小鼠中糖代謝，但對脂肪代謝的調(diào)節(jié)作用不明顯。吳茱萸次堿處理3種糖尿病模型小鼠后，肝臟中CYP2B10表達(dá)水平都有不同程度的上調(diào)。為了進(jìn)一步確定吳茱萸次堿對mCAR的激活作用，分離培養(yǎng)野生型小鼠和CAR-/-小鼠原代肝細(xì)胞，均分別給予0.1％ DMSO空白對照、250 nmol/L TCPOBOP陽性對照和系列濃度的吳

5、茱萸次堿處理，檢測CYP2B10表達(dá)量的差異;野生型小鼠和CAR-/-小鼠灌胃給予空白溶劑、苯巴比妥和吳茱萸次堿，測定吳茱萸次堿對CYP2B10的誘導(dǎo)作用。結(jié)果顯示，野生型小鼠體內(nèi)以及原代肝細(xì)胞在給予吳茱萸次堿處理后CYP2B10表達(dá)量升高，而在CAR-/-小鼠中檢測不到CYP2B10的表達(dá)，該結(jié)果進(jìn)一步證明吳茱萸次堿可以激活mCAR。
　　2.吳茱萸次堿調(diào)節(jié)糖脂代謝與CAR激活的相關(guān)性研究
　　我們的研究結(jié)果表明，吳茱萸次

6、堿可以激活mCAR，同時有文獻(xiàn)報道CAR被激活后可以調(diào)節(jié)糖脂代謝。為了闡明CAR是否可以介導(dǎo)吳茱萸次堿對糖脂代謝的調(diào)節(jié)，本章實(shí)驗(yàn)采用野生型小鼠和CAR-/-小鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行高脂培養(yǎng)，經(jīng)0.1％DMSO空白對照、250 nM TCPOBOP陽性對照和系列濃度的吳茱萸次堿處理后，提取RNA，進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn)，測定吳茱萸次堿給藥后糖異生途徑和脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，給予吳茱萸次堿處理后，野生型小鼠原代肝細(xì)胞中糖

7、異生相關(guān)基因G6pase和PEPCK的表達(dá)量以及脂肪生成相關(guān)基因SREBP-1和FAS的表達(dá)量下調(diào)，而在CAR-/-小鼠中無此作用。在原代肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本章實(shí)驗(yàn)又采用了野生型小鼠和CAR-/-小鼠模型，均隨機(jī)分成三組，分別灌胃給予空白溶劑、苯巴比妥和吳茱萸次堿，檢測給藥后葡萄糖耐受性和糖脂相關(guān)基因表達(dá)量變化的差異。結(jié)果顯示，野生型小鼠灌胃給予吳茱萸次堿后，葡萄糖耐受性得到改善，PEPCK表達(dá)量下調(diào)，而在CAR-/-小鼠中此作用消失

8、。上述結(jié)果說明CAR可以介導(dǎo)吳茱萸次堿降糖降脂作用。
　　3.吳茱萸次堿血漿代謝動力學(xué)研究
　　有研究表明，吳茱萸次堿可以誘導(dǎo)藥物代謝酶的表達(dá)，而這些代謝酶又參與到吳茱萸次堿的代謝過程中，所以本章實(shí)驗(yàn)考察了吳茱萸次堿在連續(xù)給藥后是否加快其在體內(nèi)的清除。首先建立了吳茱萸次堿血漿樣品LC-MS/MS檢測方法，并進(jìn)行專屬性、線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率等驗(yàn)證。結(jié)果顯示，專屬性良好，在0.5-100 ng/mL線性

9、范圍內(nèi)響應(yīng)良好，準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率等都符合生物樣品測定的要求。單次給藥組:將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為10組，每組5只，按10 mg/kg的給藥劑量灌胃給予吳茱萸次堿，于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24 h分別經(jīng)眼眶靜脈叢取血適量至含肝素的試管中，離心分離得到血漿，-20℃保存。采用LC-MS/MS測定血漿樣品中吳茱萸次堿濃度，經(jīng)DAS2.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)。AUC0-t為6

10、8.189μg/L·h，Cmax為16.902μg/L，CLz/F為146.65 L/h/kg。重復(fù)給藥組:取C57BL/6小鼠50只，按10 mg/kg的給藥劑量連續(xù)給藥7天，并于最后一次給藥前將小鼠隨機(jī)分為10組，每組5只。于給藥前和給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24 h分別經(jīng)眼眶靜脈叢取血適量至含肝素的試管中，離心分離得到血漿，-20℃保存。測定血漿樣品中吳茱萸次堿的濃度并計算藥動學(xué)參數(shù)。AUC0-