吳茱萸堿干預(yù)腫瘤特異糖代謝研究.pdf

1、目的：吳茱萸堿(Evodiamine，Evo)是中藥吳茱萸的有效成分，已有研究證明吳茱萸堿具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，并且起效濃度較低，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有誘導(dǎo)其凋亡的效果。通過基因芯片研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿通過抑制多條通路的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，其中涉及腫瘤特異糖代謝(Warburg效應(yīng))相關(guān)調(diào)控通路，繼而對(duì)糖代謝通路中某些關(guān)鍵酶產(chǎn)生影響。本論文將以吳茱萸堿為主，探討其對(duì)腫瘤特異糖代謝的作用及機(jī)制。
　　方法：⑴運(yùn)用Real-Ti

2、me qPCR技術(shù)探討不同時(shí)間點(diǎn)吳茱萸堿對(duì)腫瘤特異糖代謝通路和相關(guān)酶，以及凋亡基因的影響，包括HIF1-a、Akt、PFK、PRPP合成酶(PRS1)、caspase9基因的表達(dá)情況；⑵使用Western blot技術(shù)檢測(cè)吳茱萸堿對(duì)糖代謝相關(guān)酶以及凋亡相關(guān)蛋白的蛋白表達(dá)影響；⑶運(yùn)用MTT方法檢測(cè)不同濃度吳茱萸堿及其與紫杉醇聯(lián)合用藥對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的腫瘤抑制作用；⑷流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吳茱萸堿及其與紫杉醇聯(lián)合對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡作用；⑸

3、荷瘤小鼠體內(nèi)探討吳茱萸堿對(duì)小鼠肝癌轉(zhuǎn)移瘤的抑制作用，設(shè)置正常對(duì)照組、模型組、5-Fu10mg/kg陽性組、吳茱萸堿40mg/kg藥物組、吳茱萸堿80mg/kg藥物組觀察腫瘤的生長(zhǎng)及抑制情況。
　　結(jié)果：①Real-Time qPCR技術(shù)檢測(cè)吳茱萸堿對(duì)腫瘤特異糖代謝相關(guān)酶基因PFK、PRPP合成酶(PRS1)、Warburg效應(yīng)相關(guān)調(diào)控通路HIF1-a、Akt的基因，以及凋亡相關(guān)基因caspase9的作用。通過吳茱萸堿作用于肝癌細(xì)胞

4、HepG20h、12h、24h后檢測(cè)糖代謝相關(guān)酶基因PFK、PRPP合成酶(PRS1)、Warburg效應(yīng)相關(guān)調(diào)控通路HIF1-a、Akt以及凋亡相關(guān)基因caspase9的基因表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿作用12h和24h后，糖代謝相關(guān)酶基因PFK、PRPP合成酶(PRS1)基因以及Warburg效應(yīng)相關(guān)調(diào)控通路當(dāng)中HIF1-a、Akt基因與模型組相比均有不同程度的下調(diào)作用，凋亡基因caspase9與模型組相比有上調(diào)作用。以上表明吳茱萸堿

5、藥物作用下能下調(diào)糖代謝相關(guān)酶基因和Warburg效應(yīng)相關(guān)調(diào)控通路基因的表達(dá)，也能上調(diào)凋亡基因，從而抑制了腫瘤的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)其凋亡。②Western blot技術(shù)檢測(cè)吳茱萸堿對(duì)糖代謝相關(guān)酶蛋白及相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)影響。吳茱萸堿作用于肝癌細(xì)胞HepG20h、12h、24h、36h，檢測(cè)PFK等蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12h、24h吳茱萸堿作用下糖代謝關(guān)鍵酶PFK蛋白的表達(dá)受到抑制，核糖核苷酸還原酶(RR)蛋白的表達(dá)24h受到抑制;凋亡相關(guān)蛋白p

6、53蛋白表達(dá)下調(diào)，凋亡蛋白Caspase912h出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。以上初步說明吳茱萸堿對(duì)糖代謝相關(guān)酶蛋白的表達(dá)有抑制效果，但是其抑制腫瘤生長(zhǎng)及誘導(dǎo)其凋亡并沒有通過p53途徑進(jìn)行，而是從其他的通路調(diào)節(jié)從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。③吳茱萸堿及其與紫杉醇聯(lián)合對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的殺傷作用。用不同濃度的吳茱萸堿和不同濃度的紫杉醇以及聯(lián)合用藥觀察對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增效作用，0.3μmol/L吳茱萸堿聯(lián)合0.005μmol/L紫杉醇、0.3μmol/L吳茱

7、萸堿聯(lián)合0.01μmol/L紫杉醇、0.6μmol/L吳茱萸堿聯(lián)合0.005μmol/L紫杉醇、0.6μmol/L吳茱萸堿聯(lián)合0.01μmol/L紫杉醇、0.6μmol/L吳茱萸堿聯(lián)合0.005μmol/L紫杉醇、0.6μmol/L吳茱萸堿聯(lián)合0.01μmol/L紫杉醇作用于HepG2細(xì)胞抑制率分別為30％±0.007、40％±0.002、42％±0.01、49％±0.02、46％±0.04、51.3％±0.03，Q值分別為1.58、1

8、.13、1.85、1.28、1.19、1.00，并且由結(jié)果可知吳茱萸堿的抑制腫瘤生長(zhǎng)及殺傷作用具有濃度依賴性，較低濃度的吳茱萸堿與較低濃度的紫杉醇聯(lián)合用藥對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2具有協(xié)同增效的作用，Q值幾乎都大于1.15。④流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吳茱萸堿與紫杉醇對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡作用。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿與紫杉醇單藥作用于細(xì)胞均能產(chǎn)生一定的細(xì)胞凋亡效應(yīng)，而兩藥聯(lián)合使用細(xì)胞凋亡效應(yīng)增強(qiáng)，說明吳茱萸堿與紫杉醇聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)的促凋

9、亡效應(yīng)有增效作用。⑤荷瘤小鼠體內(nèi)探討證吳茱萸堿對(duì)小鼠肝癌轉(zhuǎn)移瘤的抑制作用。H22小鼠肝癌細(xì)胞接種后，通過設(shè)置模型組、5-Fu陽性組(10mg/kg)、吳茱萸堿40mg/kg組、吳茱萸堿80mg/kg組觀察腫瘤的生長(zhǎng)抑制情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-Fu陽性組（10mg/kg）、吳茱萸堿40mg/kg組與模型組相比腫瘤均有不同程度的抑制作用，抑瘤率分別是65.4％，44.78％，吳茱萸堿80mg/kg組沒有抑瘤作用，原因可能是高濃度藥物對(duì)小鼠產(chǎn)生炎癥