截斷型人轉化生長因子受體Ⅱ真核表達載體的構建和表達.pdf

1、肝纖維化在慢性肝病的病理生理過程中占重要地位，阻斷其向肝硬化發(fā)展，促使其逆轉具有重要意義，而轉化生長因子β在該過程中起重要作用，本課題旨在利用現代分子生物學和基因工程技術構建一個沒有胞內段的不能轉導胞外信號的截斷型人轉化生長因子βⅡ型受體的表達載體，為進一步研究其生物學效應及在肝硬化中的作用奠定基礎。 目的：構建無細胞內段基因的人轉化生長因子βⅡ型受體(△TβRⅡ)的真核表達載體pEGFP/△TβRⅡ，轉染人胚肝細胞L02以表達

2、融合蛋白EGFP/△TβRⅡ，并檢測其胞外段的生物學活性。 方法：以質粒H2-3FF為模板，用PCR方法擴增得到人轉化生長因子βⅡ型受體(TβRⅡ)胞外段和跨膜段的cDNA，并在兩端分別引入EcoRI和BamHI限制性內切酶位點，將該cDNA經EcoRI和BamHI雙酶切、純化回收后克隆到真核表達載體pEGFP-N2上，構建成pEGFP/△TβRⅡ重組質粒。經雙酶切和核酸測序鑒定，將該重組質粒由脂質體Lipofectamin20

3、00介導轉染人胚肝細胞L02，用倒置熒光顯微鏡觀察融合蛋白EGFP的表達，加入G418篩選得到陽性克隆，并用四唑鹽(MTT)比色法和流式細胞術(FCM)檢測其生物學活性。 結果：①重組質粒pEGFP/△TβRⅡ經EcoRI和BamHI雙酶切，得到兩個陽性片斷，其中小片段帶與PCR產物條帶在相同位置，大小分別約為619bp；大片段條帶與空載體pEGFP-N2骨架在同一位置，大小約為4.7kb，符合預期結果，并經核酸測序鑒定序列正確

4、，表明△TβRⅡ已經克隆至pEGFP-N2載體中；②重組質粒pEGFP/△TβRⅡ轉染L02人胚肝細胞24h后在熒光顯微鏡下觀察到融合蛋白EGFP的表達，并用G418篩選得到穩(wěn)定表達的陽性克?。?③MTT比色結果：轉染重組子的實驗組OD值顯著高于轉染pEGFP-N2的對照組OD值(0.780±0.012vs0.335±0.018，p＜0.05)；FCM結果顯示前者的G1％(63.58)明顯低于后者的G1％(73.03)，而增殖指