柑橘中乙螨唑農(nóng)藥的代謝和毒性機(jī)理及其殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià).pdf

1、柑橘是人們?nèi)粘Ｉ钪幸活愔匾乃?。但是在其生長(zhǎng)期內(nèi)常常受到螨類的危害。乙螨唑是一種新型的二苯基噁唑啉類手性殺螨劑，被廣泛應(yīng)用于柑橘螨的卵、幼蟲、成蟲的防治。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，農(nóng)藥被施用于田間后，部分殘留于植株表面、果實(shí)等部位，部分則進(jìn)入到土壤或沉積物等生態(tài)環(huán)境中。由于農(nóng)藥的理化性質(zhì)及外界環(huán)境的差異，使得不同農(nóng)藥在植株體內(nèi)或者生態(tài)環(huán)境中的行為呈現(xiàn)出顯著性差異。殘留在植株體內(nèi)或者果實(shí)中的農(nóng)藥，經(jīng)過人體進(jìn)食后對(duì)人體健康產(chǎn)生一定風(fēng)險(xiǎn)。而殘留于

2、土壤等生態(tài)環(huán)境中的農(nóng)藥則可能對(duì)生態(tài)環(huán)境中的非靶標(biāo)生物產(chǎn)生毒害作用。目前，對(duì)于該新型農(nóng)藥的研究?jī)H僅限于田間降解及對(duì)于靶標(biāo)生物螨類的毒性。因此，本論文針對(duì)目前乙螨唑相關(guān)信息的缺乏現(xiàn)狀，從對(duì)映體水平上研究了乙螨唑在柑橘果實(shí)中的降解代謝及其對(duì)細(xì)胞的毒性和氧化損傷效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，還研究了乙螨唑?qū)τ诜前袠?biāo)生物的毒性作用模式，論文以蚯蚓為模式生物，利用NMR檢測(cè)分析技術(shù)對(duì)不同濃度乙螨唑處理后，蚯蚓體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的變化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，明確了相關(guān)生物標(biāo)志物

3、及所影響的代謝路徑。此外，本研究還采用UPLC-QTOF/MS全掃描模式對(duì)乙螨唑在柑橘、土壤及蚯蚓體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定，明確了幾種主要代謝產(chǎn)物在三種基質(zhì)中的相對(duì)含量變化情況。最后，通過乙螨唑在柑橘上的最終殘留量及毒理學(xué)數(shù)據(jù)，評(píng)估了柑橘果實(shí)中乙螨唑殘留對(duì)于人體的潛在風(fēng)險(xiǎn)性。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴在不同的采樣間隔下，研究了R-乙螨唑和S-乙螨唑在柑橘和土壤中的降解規(guī)律。結(jié)果表明，乙螨唑?qū)τ丑w在柑橘和土壤中的降解均存在選擇性。

4、在柑橘基質(zhì)中，S-乙螨唑總是優(yōu)先于R-乙螨唑降解，造成柑橘基質(zhì)中R-乙螨唑的富集。在土壤基質(zhì)中，S-乙螨唑降解速率仍然比R-乙螨唑更快，造成R-乙螨唑在土壤基質(zhì)中富集。在兩種基質(zhì)中，對(duì)映體的比值（EF）值大于0.5，進(jìn)一步印證了R-對(duì)映體在柑橘和土壤中的持久性。從半衰期來看，R-和 S-乙螨唑在柑橘中的半衰期分別為19.2和10.8 d，在土壤中的半衰期分別為10.2和6.18 d。與其他文獻(xiàn)報(bào)道相比，半衰期存在一定差異，造成這種現(xiàn)象的

5、原因與柑橘果實(shí)大小差異、自然環(huán)境差異等均有關(guān)系。⑵將制備的R-乙螨唑和S-乙螨唑純單體用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成0.01，0.05，0.1，0.5和1.0 mM染毒液。研究24 h染毒后，乙螨唑?qū)τ丑w對(duì)于MCF-7癌細(xì)胞的細(xì)胞活性及氧化損傷的影響。從細(xì)胞活性MTT實(shí)驗(yàn)和LDH釋放量結(jié)果看出，隨著染毒濃度的增加，經(jīng)過R-，Rac-及S-乙螨唑處理后的細(xì)胞活性均開始下降。在低濃度下，三種形式的乙螨唑處理后，對(duì)細(xì)胞活性的影響無(wú)顯著性差異。但是當(dāng)濃度逐

6、漸增加時(shí)，R-乙螨唑表現(xiàn)出最大的細(xì)胞活性抑制率，其次是 Rac-乙螨唑，細(xì)胞活性下降最低的為S-乙螨唑；乙螨唑?qū)τ诩?xì)胞的氧化損傷采用ROS含量，CAT和SOD酶活性等指標(biāo)來評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，和細(xì)胞毒性類似，R-乙螨唑誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷比其對(duì)映異構(gòu)體更高，說明R-乙螨唑?qū)CF-7細(xì)胞的毒性比S-乙螨唑高。⑶將個(gè)體均一的蚯蚓暴露于乙螨唑濃度為10,50和100 mg/kg的土壤中后，在暴露的第2 d和第14 d采集蚯蚓樣品，用于NMR檢測(cè)分

7、析。從PCA和OPLS-DA分析圖上可以看出，乙螨唑處理組和對(duì)照組之間或者不同濃度處理組之間分離效果良好，呈現(xiàn)出明顯的組內(nèi)聚類現(xiàn)象。通過方差分析（ANOVA）和變量中重要的化合物（VIP）分析，14種蚯蚓內(nèi)源物包括氨基酸、糖類、生物小分子物質(zhì)，在乙螨唑處理后，相對(duì)含量發(fā)生了顯著性的變化。三甲胺-N-氧化物被認(rèn)為是乙螨唑處理后的特征性變化物質(zhì)。通過KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，明確了這些生物標(biāo)志物相關(guān)的體內(nèi)代謝路徑，即為乙螨唑影響的蚯蚓體內(nèi)的特征性

8、代謝路徑。⑷用一定量的乙螨唑處理柑橘、土壤和蚯蚓樣品后，在不同的時(shí)間間隔采集3種基質(zhì)樣品。用UPLC-QTOF/MS全掃描模式監(jiān)測(cè)乙螨唑在3種基質(zhì)中的代謝物。乙螨唑暴露第14 d時(shí)，在柑橘基質(zhì)中檢測(cè)到4種代謝產(chǎn)物，在土壤基質(zhì)中檢測(cè)到11種代謝產(chǎn)物，在蚯蚓基質(zhì)中檢測(cè)到8種代謝產(chǎn)物。針對(duì)幾種主要的、毒性可能較大的代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。結(jié)果表明，大部分的代謝產(chǎn)物隨著暴露時(shí)間的增加逐漸下降，而代謝產(chǎn)物M1和M3隨著暴露時(shí)間的增加呈現(xiàn)出增

9、加的趨勢(shì)，顯示出一定的持久性，應(yīng)當(dāng)引起重視。⑸以不同施藥濃度、不同施藥間隔期、不同的施藥次數(shù)將乙螨唑制劑噴施于柑橘果實(shí)上，設(shè)置空白對(duì)照組，每個(gè)處理重復(fù)3次。樣品經(jīng)過UPLC-MS/MS定量分析后，得到不同的施藥模式下，乙螨唑在柑橘果實(shí)中的最大殘留量和平均殘留量。通過相關(guān)公式計(jì)算得到乙螨唑?qū)τ谌梭w的急性風(fēng)險(xiǎn)值和慢性風(fēng)險(xiǎn)值。本研究中，由于乙螨唑的急性劑量參考值（ARfD）值未給出，所以不能計(jì)算乙螨唑?qū)τ谌梭w的急性風(fēng)險(xiǎn)。不同的施藥劑量、時(shí)間間