RNAi對胃癌SGC7901-VCR細胞多藥耐藥性的抑制作用.pdf

1、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是一種雙鏈RNA在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達使其沉默的過程，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-tranceriptionalgenesilencing，PTGS)，這一現(xiàn)象在不同種屬的生物體中發(fā)現(xiàn)。近年來RNA干擾的研究成為熱點。小分子干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)是長度為21-23nt的小片段雙鏈RNA，由雙鏈RNA經(jīng)Dicer切

2、割而成，siRNA可特異識別其同源的mRNA，并切割其中與siRNA反義鏈互補的區(qū)域，從而抑制靶基因的表達。利用這種RNA干擾技術(shù)封閉某些多藥耐藥基因，阻止相應(yīng)蛋白的表達具有重要價值。 多藥耐藥(Multidrugresistance,.MDR)是指腫瘤細胞接觸某種化療藥物并產(chǎn)生耐藥性，同時對其他多種結(jié)構(gòu)和作用機制不同的化療藥物也產(chǎn)生耐藥性，MDR是腫瘤化療失敗的主要原因。MDR產(chǎn)生的原因很多，主要機制為mdrl基因的過度編碼

3、表達，進而產(chǎn)生一種ATP能量依賴性的糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)。P-gp可以將不同結(jié)構(gòu)的化療藥物從細胞內(nèi)泵出，導(dǎo)致胞漿中藥物累積量減少，使得腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥。針對MDR產(chǎn)生的機制，已發(fā)現(xiàn)一系列可以逆轉(zhuǎn)耐藥的方法，靶向siRNA可以通過特異性抑制mdrl編碼的mRNA，使得P-gp的表達水平下調(diào)，從而達到耐藥逆轉(zhuǎn)的效果。RNAi在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的研究中具有重要地位。 為探討體外合成siRNA用于逆轉(zhuǎn)腫瘤細

4、胞多藥耐藥的可行性，作者設(shè)計并體外轉(zhuǎn)錄2條含21個核苷酸的siRNA轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901/VCR細胞，檢測阿霉素在細胞內(nèi)的蓄積，觀察siRNA封閉目的基因，阻止相應(yīng)蛋白表達的效果，為進一步將RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。 方法：本實驗根據(jù)mdrlcDNA已知序列，設(shè)計并體外轉(zhuǎn)錄2條含21核苷酸的siRNA(mdrlsi2631和mdrlsi3071)，轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細胞，用PT-PCR檢測mdrl基因mRNA

5、的表達，免疫組化檢測P-gp的表達，流式細胞儀檢測阿霉素在細胞內(nèi)的蓄積，MTT法檢測細胞對阿霉素的敏感性。 結(jié)果：1、siRNA對mdrlmRNA表達的影響SGC7901/VCR細胞轉(zhuǎn)染siRNA48h后，mdrl—mRNA表達明顯下降，mdrlsi2631組的細胞內(nèi)阿霉素熒光陽性率增加幅度較mdrlsi3071組的大(P＜0.05)接近親本SGC7901細胞水平。 2、P-gp表達的變化SABC免疫組化顯示，P-g

6、p陽性呈棕黃色顆粒，位于細胞膜。SGC7901/VCR細胞轉(zhuǎn)染siRNA48h后，P-gp的免疫反應(yīng)性(immunoreactivity,IR)減弱，P-gp表達減少,mdrlsi2631組的陽性區(qū)積分光密度由處理前的72483886±322136.89降至203230.78±177565.45，(P＜0.001)，接近親本SGC7901細胞的146806.4635±106591.34。mdrlsi3071組降至351078.12±15

7、5505.42(P＜0.001)，尚未達到親本SGC7901細胞的水平(P＜0.001)，mdrlsi2631組和mdrlsi3071組間的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染試劑組的陽性區(qū)積分光密度處理前后的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 3、細胞內(nèi)阿霉素蓄積的改變SGC7901/VCR細胞轉(zhuǎn)染siRNA48h后，細胞內(nèi)阿霉素熒光陽性率增加，阿霉素特異性熒光強度增強(P＜0.05)，mdrlsi2631和mdrlsi3

8、071組的SGC7901/VCR細胞的細胞內(nèi)阿霉素熒光陽性率和阿霉素特異性熒光強度均未達到親本SGC7901細胞的水平(P＜0.05)。 4、抗腫瘤藥物敏感性變動siRNA作用48h后的SGC7901/VCR細胞對化療藥物阿霉素的IC50減少，相對逆轉(zhuǎn)率增加，以mdrlsi2631組和SGC7901/VCR細胞對化療藥物阿霉素的IC50減少顯著(P＜0.05)，但未達到親本SGC7901細胞的水平(P＜0.05) 結(jié)