鹽霉素逆轉胃癌細胞SGC-7901-VCR多藥耐藥的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　 胃癌是世界常見的惡性腫瘤之一，特別是在我國，胃癌的發(fā)病率僅次于肺癌，位居惡性腫瘤致死率的第二位。目前，胃癌的治療以手術、化療、放療等綜合治療為主。對于中晚期胃癌患者，由于已失去手術的最佳時機，化療則是最佳選擇。但是隨著化療周期的增加，腫瘤的多藥耐藥則成為嚴重影響化療效果主要原因之一。腫瘤多藥耐藥在臨床腫瘤治療中已普遍存在，成為目前腫瘤治療的主要障礙之一。
　　 多藥耐藥(MDR)是導致化療失敗的主要原因

2、，因此腫瘤耐藥成為臨床上腫瘤治療的最大挑戰(zhàn)。在過去的幾十年里，許多的理論方法被提出并用來解決這一問題，其中最重要的就是耐藥逆轉藥物。多藥耐藥(MDR)是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時，對其他結構及作用機制不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。目前，用來闡述MDR產(chǎn)生機制的理論有多種，其中ABC轉運蛋白家族中的ABCB1(MDR1/Pgp)、ABCC1-MRP1和ABCG2-BCRP是最佳的，特別是ABCB1(MDR1)編碼的P

3、-gp通過積極外排多種抗腫瘤藥物在腫瘤耐藥中起著關鍵作用。已知的P-gp的底物包括某些抗腫瘤藥物，例如:紫杉醇(paclitaxel)阿霉素(doxorubicin)和長春新堿(vinblastine)。
　　 近年來，腫瘤干細胞(CSC)學說的提出更加豐富了腫瘤耐藥機制的研究。近年來，腫瘤干細胞(CSC)學說的提出更加豐富了腫瘤耐藥機制的研究。CSC學說認為腫瘤組織中存在極少量腫瘤細胞，與大部分已分化和不能自我更新的腫瘤細胞相

4、比，其具有自我更新、多向分化以及推動腫瘤生長的能力。腫瘤干細胞(CSC)學說還認為腫瘤干細胞是腫瘤耐藥、轉移和復發(fā)的根源，這是由于化療藥物能夠殺死已分化或正在分化的腫瘤細胞卻不能殺死腫瘤干細胞。
　　 鹽霉素(Salinomycin)是一種羧酸聚醚類抗生素。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)，鹽霉素不僅可以抑制和殺滅腫瘤細胞，而且體內(nèi)外實驗表明其尚可抑制腫瘤干細胞。鹽霉素抑制乳腺癌腫瘤干細胞比例的能力是普通化療藥物的100多倍。其作為抗腫瘤和抗

5、腫瘤干細胞藥物的機制尚未闡明，但通過誘導上皮細胞分化而非觸發(fā)細胞毒性的可能性較大。進一步的研究證明，鹽霉素通過克服多重耐凋亡機制的作用，誘導不同來源的人類腫瘤細胞發(fā)生大量調(diào)凋亡。最近，通過對過表達P-gp的腫瘤細胞進行藥物外排實驗表明鹽霉素是多藥耐藥蛋白P-gp的較強抑制劑。
　　 研究目的:
　　 檢測胃癌耐藥細胞系SGC-7901/VCR的多重耐藥性，分析相關耐藥機制;觀察和探討鹽霉素逆轉SGC-7901/VCR多藥

6、耐藥性的效果及機制。
　　 方法:
　　 1、選擇胃癌細胞系SGC-7901和SGC-7901/VCR細胞作為實驗細胞，觀察細胞形態(tài)，檢測兩種細胞的生長曲線、細胞周期、多重耐藥性等體外生物學特性。
　　 2、裸鼠成瘤實驗對比兩細胞株在體內(nèi)的致瘤性。
　　 3、通過多種實驗方法分析耐藥細胞SGC-7901/VCR的耐藥機制:
　　 3.1、流式檢測兩細胞系中的側群比例，并用Western blot檢

7、測與之相關的常見ABC轉運蛋白ABCG2以及MDR1/Pgp的表達;
　　 3.2、流式檢測胃癌干細胞標記CD44、EpCAM在兩細胞的表達量及差異;
　　 3.3、通過腫瘤球的培養(yǎng)，間接檢測兩細胞株中干細胞比例的差異;
　　 3.4、Western blot檢測常用干細胞因子Nanog、SOX-2、OCT3/4及C-myc在兩細胞株的表達量及差異。
　　 4、用鹽霉素處理兩細胞株，通過各種實驗方法觀察其

8、逆轉耐藥株SGC-7901/VCR的效果，并探討其機制:
　　 4.1、MTT法檢測鹽霉素抑制兩細胞株增值的IC50值，觀察耐藥株是否對鹽霉素耐藥;
　　 4.2、聯(lián)合應用鹽霉素和VCR，MTT檢測其耐藥逆轉指數(shù);
　　 4.3、MDR efflux assay檢測鹽霉素對耐藥細胞株蓄積ADM的作用;
　　 4.4、流式檢測兩細胞凋亡率的變化及差異;
　　 4.5、流式檢測耐藥細胞株側群比例的變化

9、，并用WB檢測相關ABC轉運蛋白的表達量變化;
　　 4.6、流式檢測EpCAM的表達變化;
　　 4.7、不同濃度鹽霉素處理兩細胞株后做腫瘤球培養(yǎng)，觀察其對腫瘤球形成的抑制作用，并WB檢測相關干細胞因子的表達量變化。
　　 5、統(tǒng)計方法
　　 實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析:兩樣本比較采用獨立樣本t檢驗分析;多種樣本比較One-way ANOVA比較各組細胞的差異，用LSD法進行多重比

10、較;如果方差不齊，采用近似F檢驗（Welch法）及多重比較的Tamhane法分析。結果以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示。
　　 結果:
　　 1.耐藥細胞的培養(yǎng)與鑒定
　　 (1).光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)
　　 SGC-7901細胞呈上皮樣單層排列貼壁生長，細胞大小不一，大部分以多角形細胞占優(yōu)勢，梭形細胞和巨大細胞所占比例均極少，細胞邊界清楚，增殖較迅速，可培養(yǎng)3d-4d傳代一次。SGC-7901/VC

11、R細胞同樣呈上皮樣單層排列貼壁生長，細胞大小不一，大部分呈梭形，細胞增殖迅速，可培養(yǎng)3d-4d傳代一次。
　　 (2).細胞增殖
　　 MTT檢測測定OD值，并繪制細胞增殖曲線，SGC-7901、SGC-7901/VCR細胞均有接觸抑制期、對數(shù)生長期和細胞死亡期。自第5天開始，SGC-7901/VCR和SGC-7901細胞的體外增殖能力具有統(tǒng)計學差異(F=24.755，P=0.000)。流式檢測兩株細胞的細胞周期，SGC

12、-7901細胞的G0/G1、S和G2/M三期的比例分別為44.700±1.400％、43.366±3.197％和11.933±2.074％，SGC-7901/VCR細胞的分別為37.200±1.908％、56.133±2.747％和6.667±1.518％; SGC-7901細胞的PI（增殖指數(shù)，表示細胞的增殖活性）為55.300±1.400％，SGC-7901/VCR細胞PI為62.800±1.908％，兩者之間具有統(tǒng)計學差異(t=-

13、5.489，P=0.005)。
　　 (3).裸鼠體內(nèi)成瘤實驗
　　 注射細胞總數(shù)分別為5×106，1×106，1×105和1×104個SGC-7901/VCR細胞觀察4W，均可見瘤體形成，成瘤所需要的最低細胞數(shù)僅為10000個。而SGC-7901細胞注射細胞數(shù)目1×104個，觀察4W未見瘤體形成，注射1×105細胞才可見腫瘤形成。提示SGC-7901/VCR細胞較SGC-7901細胞有更強大的致瘤能力。
　　

14、(4). MTT檢測SGC-7901/VCR細胞的多藥耐藥性
　　 對VCR、ADM、Taxol、DDP這四種化療藥物，SGC-7901/VCR均顯示耐藥性，其IC50分別為2.530±0.287μM、9.030±0.737μM、0.583±0.076μM、3.327±0.172μM，而SGC-7901細胞則相對敏感，其IC50明顯較小，分別為0.073±0.020μM、0.340±0.118μM、0.066±0.008μM、1

15、.347±0.315μM，兩細胞任一相同藥物之間均具有顯著差異(P＜0.05)。耐藥細胞較親本細胞對四種化療藥物的耐藥倍數(shù)分別為36.0、27.0、7.10、2.46。
　　 2.SGC-7901/VCR細胞多藥耐藥機制的研究
　　 (1).流式檢測SGC-7901和SGC-7901/VCR細胞SP比例分別為0.067±0.115％和88.900±11.966％，兩者之間差異具有統(tǒng)計學意義(t=-12.858，P=0.0

16、06)。ABCtransporter家族與SP表型密切相關，特別是MDR1-Pgp和ABCG2，Western blot結果示SGC-7901細胞中MDR1-Pgp與ABCG2均不表達，而SGC-7901/VCR細胞不表達ABCG2，而是高表達MDR1-Pgp。在MDR1-Pgp的表達上，SGC-7901與SGC-7901/VCR細胞具有明顯的差異。
　　 (2).流式檢測SGC-7901和SGC-7901/VCR細胞中CD44

17、+細胞比例分別為95.400±3.400％和95.433±2.139％，均高表達CD44+細胞，沒有顯著差異(t=-0.014，P=0.989)。而EpCAM+細胞比例分別為22.733±2.554％和93.667±4.723％，兩者之間的差異具有統(tǒng)計學意義(t=-22.883，P=0.000)。
　　 (3). SGC-7901與SGC-7901/VCR細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天以后發(fā)現(xiàn)SGC-7901細胞不形成或形成較小

18、的腫瘤球，SGC-7901/VCR細胞形成較大的腫瘤球。每1000個SGC-7901和SGC-7901/VCR細胞形成的腫瘤球個數(shù)分別為0和36.000±5.568個，兩者之間具有明顯的差異，差異具有統(tǒng)計學意義(t=-11.199，p=0.000)。Western blot實驗結果發(fā)現(xiàn)，在SGC-7901細胞表達只表達C-myc，而SGC-7901/VCR細胞表達Nanog和C-myc。在C-myc的表達上，SGC-7901與SGC-7

19、901/VCR細胞沒有差異;在Nanog的表達上，兩者具有明顯的差異。
　　 3.鹽霉素逆轉SGC-7901/VCR多藥耐藥及其機制的研究
　　 (1). MTT檢測鹽霉素對SGC-7901和SGC-7901/VCR細胞的劑量效應，IC50分別為1.755±0.182μM和2.480±0.174μM，具有統(tǒng)計學差異(t=-4.978，P=0.008)。經(jīng)1μM、2μM和4μM鹽霉素作用后，檢測SGC-7901/VCR細胞

20、對VCR的IC50分別為0.710±0.060μM、0.410±0.040μM和0.210±0.020μM，與未處理組(0μM)相比，均具有顯著差異(P＜0.05)。逆轉指數(shù)分別為3.420、5.930和11.57。MDRexfflux assay證實鹽霉素能增加SGC-7901/VCR細胞內(nèi)多柔比星的濃度，而且這種作用具有濃度依賴性。
　　 (2).在0μM、1μM、2μM和4μM鹽霉素作用后，SGC-7901細胞的凋亡率分別

21、為1.700±1.300％、21.433±4.496％、58.800±4.331％和79.800±3.869％，SGC-7901/VCR細胞的凋亡率分別為1.767±1.850％、21.033±5.804％、58.200±6.596％和81.233±3.037％。所以，隨著鹽霉素濃度的增加，SGC-7901和SGC-7901/VCR細胞的凋亡率都隨之增加(F=417.850，P=0.000)，相同藥物濃度下兩細胞的凋亡率沒有差異(F=0

22、.069，P=0.976)。
　　 (3). SGC-7901/VCR細胞經(jīng)不同濃度鹽霉素（0μM、1μM、2μM和4μM）作用48h后，收集細胞行SP檢測，發(fā)現(xiàn)SP比例隨著鹽霉素濃度的增加逐漸降低，分別為93.733±6.351％、54.967±5.784％、30.567±4.92％和11.700±2.663％(F=128.332，P=0.000)，而MDR1-Pgp的表達量也隨之逐漸降低。
　　 (4).SGC-79

23、01/VCR細胞經(jīng)不同濃度鹽霉素0μM、1μM、2μM和4μM處理48h后，繼續(xù)在無血清培養(yǎng)基下培養(yǎng)腫瘤球，約30d后發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度逐漸增加，腫瘤球的形成逐漸受到抑制，而且腫瘤球的大小也隨之變小。干細胞因子Nanog表達量也隨之降低。
　　 (5).鹽霉素可降低SGC-7901和SGC-7901/VCR細胞EpCAM+細胞的比例，兩細胞經(jīng)不同濃度鹽霉素（0μM、1μM、2μM和4μM）作用48h后，流式檢測EpCAM+細胞的

24、比例分別為:26.667±2.616％、20.600±4.444％、66.667±1.242％和2.767±0.603％;90.500±5.839％、57.067±6.467％、21.567±6.048％和7.900±4.158％。
　　 隨著藥物濃度的增加，每種細胞各個處理組之間均具有顯著差異(F=177.240，P=0.000)。
　　 結論:
　　 1.與親代細胞SGC-7901相比，耐藥細胞SGC-790