人胃癌細(xì)胞SGC7901中CSCs樣細(xì)胞篩選及DADS誘導(dǎo)的生長抑制作用.pdf

1、目的:腫瘤干細(xì)胞(CSCs)被確定為腫瘤中獨(dú)特的亞群,擁有啟動(dòng)腫瘤生長和維持腫瘤自我更新的能力,有研究顯示胃癌中存在著對化療耐藥的腫瘤干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室前期工作表明,二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)可誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞增殖抑制、分化與細(xì)胞周期G2/M期阻滯,但其對腫瘤干細(xì)胞是否起抑制作用尚未闡明。本研究目的在于利用細(xì)胞表面標(biāo)記CD44分選胃癌細(xì)胞系中的CSCs樣細(xì)胞,然后分析DADS對其體外增殖能力與細(xì)胞周期分布

2、的影響,并初步探討DADS抑制人胃癌CSCs樣細(xì)胞作用的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.RT-PCR、Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測DADS對SGC7901細(xì)胞中Aurora-A、Aurora-B表達(dá)的影響。
　　2.MACS技術(shù)篩選CD44(+)胃癌CSCs樣細(xì)胞,通過熒光顯微鏡觀察、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行初步鑒定。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)觀察DADS對CD44(+)胃癌CSCs樣細(xì)胞周

3、期分布的影響
　　4.免疫細(xì)胞化學(xué)分析DADS對CD44(+)胃癌CSCs樣細(xì)胞Aurora-A、Aurora-B表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR結(jié)果顯示,15mg·L-1 DADS處理SGC7901細(xì)胞24h、48h后,Aurora-A、Aurora-B mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05);Western blot發(fā)現(xiàn),15mg·L-1 DADS處理SGC7901細(xì)胞24h、48h后,Aurora-A

4、、Aurora-B蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性下降( P<0.05);免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明,15mg·L-1 DADS處理SGC7901細(xì)胞24h、48h后, Aurora-A和Aurora-B蛋白表達(dá)逐漸降低(P<0.05)。
　　2.熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),分選后CD44(+)組大多數(shù)細(xì)胞可清晰地呈現(xiàn)綠色熒光,其陽性率約為95％,明顯高于分選前胃癌SGC7901細(xì)胞及分選后CD44(-)胃癌細(xì)胞(P<0.05)。倒置顯微鏡觀察,三種

5、細(xì)胞大而圓,胞漿豐富,在形態(tài)學(xué)上并無明顯差異。
　　3.軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, CD44(+)胃癌CSCs樣細(xì)胞組集落形成數(shù)(13.68±3.45)明顯多于胃癌SGC7901細(xì)胞組(3.37±1.08)及CD44(-)胃癌細(xì)胞組(3.74±1.23),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而CD44(-)胃癌細(xì)胞組與胃癌SGC7901細(xì)胞組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在集落形態(tài)上, CD44(+)細(xì)胞組較 CD44(-)胃

6、癌細(xì)胞及胃癌 SGC7901細(xì)胞組形成的集落直徑大、細(xì)胞數(shù)量多、透光度低。DADS處理CD44(+)細(xì)胞后集落形成結(jié)果:15mg·L-1 DADS處理組(集落數(shù)為<6.75±3.25>)、30mg·L-1 DADS處理組(集落數(shù)為<3.28±1.25>)集落數(shù)目明顯低于CD44(+)細(xì)胞未處理組(13.48±4.08),15、30mg·L-1 DADS對CD44(+)細(xì)胞軟瓊脂集落形成的抑制率分別為49.93%、76.81%,抑制作用呈

7、劑量依賴性關(guān)系(P<0.05)。在集落形態(tài)上,30mg·L-1 DADS處理組較15mg·L-1 DADS處理組及未處理組形成的集落直徑小、細(xì)胞數(shù)量少、透光度高。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:與分選后CD44(-)胃癌細(xì)胞組比較,分選后CD44(+)細(xì)胞周期中S期細(xì)胞百分比增高,且增殖指數(shù)也增高(P<0.05),說明分選后CD44(+)細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)。15mg·L-1、30mg·L-1 DADS分別處理分選CD44(+)細(xì)胞24

8、h、48h,其S期細(xì)胞百分比逐漸下降,而G2/M期細(xì)胞百分比明顯高于未處理組(P<0.05),且增殖指數(shù)也降低(P<0.05),且呈明顯的藥物濃度依賴效應(yīng),表明 DADS可明顯抑制 CD44(+)細(xì)胞的增殖并阻滯細(xì)胞于G2/M期。
　　5.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:CD44(+)細(xì)胞中Aurora-A和Aurora-B蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性,15mg·L-1DADS處理后表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功