ERβ對小鼠海馬actin細胞骨架聚合與學習記憶的調節(jié)作用研究.pdf

1、研究報道隨著年齡的逐漸增長，老化所引起的雌激素(estrogen，E2)水平降低在癡呆癥如阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)的學習記憶方面扮演著重要的角色。目前，AD的具體發(fā)病機制仍未完全明確，現(xiàn)有的治療方案療效并不理想。因此，研究探索AD的發(fā)病機理和治療方法對于預防和治療AD，促進醫(yī)療護理和家庭照護都具有深遠的影響。
　　E2不僅可以影響女性的生理發(fā)育，還在改善老年的記憶力衰退方面也具有積極的作用，在調

2、控海馬突觸可塑性以及學習記憶的調節(jié)過程中需要借助雌激素受體(estrogen receptor,ER)的參與來產(chǎn)生作用。E2的受體分為兩大類:一類是膜受體GPR30，位于細胞內(nèi)的膜性成分包括細胞膜、線粒體膜、內(nèi)質網(wǎng)等，通過第二信使途徑介導E2對某些生理功能的調節(jié);另一類是經(jīng)典的核受體，包括雌激素α受體(estrogen receptorα，ERα)和雌激素β受體（estrogen receptorβ，ERβ），它們主要在細胞核內(nèi)通過與D

3、NA結合從而調節(jié)靶基因的轉錄。類固醇受體輔助活化因子-1(steroid receptor coactivator-1，SRC-1)作為是促進核受體調節(jié)靶基因轉錄活動所必需的輔助因子之一，高表達于海馬、大腦皮層等腦區(qū)，其表達受產(chǎn)后發(fā)育和性腺切除的影響。有研究表明在給予卵巢切除手術和核受體抑制劑處理后海馬突觸蛋白表達和突觸及樹突棘密度明顯下降，雌激素替代治療及其核受體激動劑可以增加突觸蛋白的表達和樹突棘的密度，但ERβ在當中的作用機制目前

4、尚不明確。
　　ERβ克隆于1996年，過去20年的研究發(fā)現(xiàn)ERβ在多種動物的體內(nèi)均有較為廣泛的表達，并且參與了E2對多種腦功能作用的調節(jié)，且在不同的分區(qū)其表達分布和功能作用也不盡相同。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，大腦皮層、海馬等區(qū)域有大量ERβ的表達，提示ERβ可能扮演著介導E2調控學習記憶的功能性受體的角色。在生殖系統(tǒng)，睪丸、卵巢等組織器官內(nèi)可檢測到ERβ的存在，它可能參與E2調節(jié)生殖細胞的生長、分化等過程。另外，在心血管、消化道等系統(tǒng)

5、內(nèi)也可檢測到ERβmRNA，并且也具有十分重要生理意義。腦內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，利用ERβ特異性拮抗劑以及基因敲除等方法抑制ERβ后，發(fā)現(xiàn)海馬突觸蛋白表達顯著下降，樹突棘密度降低，出現(xiàn)空間學習記憶障礙。通過ERβ激動劑活化ERβ可改善突觸可塑性和提高空間學習記憶，提示ERβ對學習記憶有著重要的調控作，但是其具體機制尚不清楚。
　　肌動蛋白(actin)是構成細胞骨架的重要成分，actin聚合與解聚的動態(tài)變化是突觸可塑性的基礎，也是學習記憶

6、的基礎。球狀肌動蛋白(即G-actin)在Profilin-1等分子的誘導下聚合成為螺旋狀的肌動蛋白(F-actin)。因此，F(xiàn)-actin/G-actin比例的變化常作為衡量的肌動蛋白聚合程度的指標。研究還發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體2（mammalian target of rapamycincomplex2，mTORC2）對actin細胞骨架的聚合有著重要的調節(jié)作用，敲除mTORC2的核心成分Rictor導致actin聚合程度

7、與樹突棘密度下降，并導致嚴重的學習記憶障礙，而直接激活Rictor的效應分子p-AKT(AKT ser473)可逆轉上述學習記憶障礙，證明mTORC2在調節(jié)actin細胞骨架聚合與學習記憶中的重要作用。既往研究報道ERβ可調節(jié)樹突棘密度和學習記憶行為，但是ERβ是否調控actin細胞骨架聚合尚不清楚。
　　目的:
　　探討ERβ在調控海馬神經(jīng)元actin細胞骨架多聚化以及學習記憶中的作用及其機制。
　　方法:
　

8、　1、為了解ERβ在生后小鼠不同時相點海馬的表達情況，我們運用蛋白質免疫印跡(Western blot，WB)、免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)實驗方法檢測了ERβ在生后不同發(fā)育時期(P0，P7，P14，P28，P56)雌、雄小鼠海馬的表達變化。
　　2、為了探討激活ERβ對海馬actin細胞骨架聚合以及學習記憶的影響，將成年小鼠進行卵巢切除(ovariectomy，OVX)，1w后在頸背部皮下注射不同

9、劑量ERβ激動劑DPN進行預實驗，分為假手術對照(Control)、卵巢切除(OVX)、OVX+1.25mg/kg DPN、OVX+2.5mg/kg DPN、OVX+5.0mg/kg DPN共5組，通過檢測上述處理條件下海馬SRC-1、Rictor及下游靶分子p-AKT以及actin細胞骨架聚合蛋白(p-cofilin/cofilin、Profilin-1)的表達變化確定DPN處理的最佳劑量。然后，在最佳劑量(5.0mg/kg DPN)

10、的處理條件下，檢測了DPN對OVX后上述分子表達、actin聚合狀態(tài)(F-actin/G-actin比值)的變化、海馬樹突棘密度以及學習記憶行為變化的調控。
　　3、取成年動情間期雌性小鼠，腹腔注射相同劑量（100ug/kg）ERβ抑制劑PHTPP，分為溶劑對照(Control)及PHTPP注射1、3、5、7d共5組，通過檢測海馬SRC-1、Rictor及下游靶分子p-AKT、p-cofilin/cofilin、Profilin-

11、1的表達變化來確定PHTPP處理的最佳時間點。然后，在此最佳時間點(7d)條件下，運用Morris水迷宮方法觀察小鼠空間記憶行為的變化情況，用WB、IHC以及高爾基鍍銀染色等方法來檢測抑制ERβ活性后海馬SRC-1、Rictor、p-AKT和actin細胞骨架聚合蛋白(p-cofilin/cofilin、Profilin-1)的表達變化、actin聚合狀態(tài)(F-actin/G-actin比值)、海馬區(qū)的樹突棘密度的變化，以此來探索ERβ

12、活性改變與學習記憶之間的相互聯(lián)系。
　　結果:
　　1、ERβ在雌、雄小鼠P0、P7、P14、P28、P56海馬中都有表達。在P0時表達高，在P7和P14時表達下降，在P28和P56時表達增加。雄性小鼠在P28時達到P0時水平，但雌性小鼠在P28時就已高于P0時的表達。
　　2、OVX后海馬SRC-1、Rictor及下游靶分子p-AKT、actin細胞骨架聚合蛋白(p-cofilin/cofilin、Profilin-

13、1)表達均下降，1.25mg/kg DPN時僅Profilin-1的表達增加而其余分子表達無明顯變化，在2.5-5.0mg/kg DPN時上述所有分子表達較OVX組上升，因此，選取5.0mg/kg為DPN的最佳劑量。Morris水迷宮發(fā)現(xiàn)OVX后雌性小鼠的學習記憶下降，高爾基鍍銀染色結果顯示OVX組海馬樹突棘密度減少，免疫組織化學實驗（immunohistochemistry,IHC）和蛋白印跡實驗(Western blot，WB)顯示

14、OVX組SRC-1、Rictor及下游靶分子p-AKT、actin細胞骨架聚合調控蛋白、actin聚合狀態(tài)(F-actin/G-actin比值)的表達下降，5.0mg/kg DPN處理可以逆轉OVX所致的上述變化。
　　3、海馬SRC-1、Rictor、p-AKT、actin細胞骨架聚合調控蛋白(p-cofilin/cofilin、Profilin-1)在給予PHTPP注射5d時表達開始下降，除Profilin-1外其余各分子表達

15、在7d時顯著下降，因此，確定7d為PHTPP處理的最佳時間。在此條件下，Morris水迷宮發(fā)現(xiàn)PHTPP可致雌性小鼠的學習記憶下降，高爾基鍍銀染色結果顯示海馬樹突棘密度減少，IHC和Western blot顯示PHTPP下調海馬SRC-1、Rictor及下游靶分子p-AKT、actin細胞骨架聚合相關蛋白、actin聚合程度（F-actin/G-actin比值）的表達。
　　結論:
　　1、ERβ在雌、雄小鼠生后海馬內(nèi)(P0

16、～P56)均有表達，且在出生時和成年時維持在較高水平，呈現(xiàn)出“U-型”變化的趨勢。
　　2、激活ERβ可逆轉OVX所致的海馬SRC-1、Rictor及下游靶分子p-AKT、actin細胞骨架聚合蛋白表達及海馬樹突棘密度的下降、actin聚合狀態(tài)的解聚和學習記憶行為障礙，提示活化ERβ可通過促進actin細胞骨架的聚合進而影響學習記憶行為。
　　3、抑制ERβ可下調海馬SRC-1、Rictor及下游效應分子p-AKT、acti

17、n細胞骨架聚合蛋白表達以及海馬樹突棘密度，促進actin聚合狀態(tài)的解聚，動物出現(xiàn)明顯的學習記憶行為障礙，提示抑制ERβ活性通過促進actin細胞骨架的解聚進而導致學習記憶行為障礙。
　　綜上所述，在本研究中，采用了卵巢切除、Morris水迷宮、IHC、Western blot以及高爾基鍍銀染色等多種實驗技術，研究了調節(jié)ERβ活性變化對小鼠空間學習記憶行為以及SRC-1、mTORC2通路蛋白和actin細胞骨架聚合的影響，結合文獻我