四物湯類方用于婦科血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的物質(zhì)基礎與配伍規(guī)律研究——香附四物湯的基礎研究.pdf

1、本論文研究工作為“江蘇省高校自然基金重大基礎研究資助項目-四物湯類方治療婦科血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的物質(zhì)基礎與配伍規(guī)律研究”的部分研究內(nèi)容。
　　 論文分六個章節(jié)討論。
　　 一、文獻研究。
　　 該部分對相關文獻進行整理,較系統(tǒng)地綜述了四物湯類方治療婦科血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的傳統(tǒng)與現(xiàn)代認識,并對香附四物湯配伍效應及其物質(zhì)基礎研究進展進行綜述。
　　 二、在綜合分析文獻的基礎上,理出研究思路,設計可行的實驗方案和技

2、術路線。
　　 三、通過知識挖掘描述香附四物湯的組方結構與特點。
　　 基于文獻數(shù)據(jù)挖掘,對香附四物湯組方原則及配伍規(guī)律進行探討分析;從中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)庫中檢索出包含香附-延胡索等五個藥對治療痛經(jīng)的方劑,建立數(shù)據(jù)庫,對其出現(xiàn)頻率進行統(tǒng)計分析。結果,香附四物湯方中的當歸、香附和延胡索相似度較高,是本方主要組成單元;在154首治療痛經(jīng)的方劑中,香附-當歸藥對使用頻次較高,香附-延胡索藥對最常與四物湯配合運用。
　　 四、

3、香附四物湯的的效應評價與物質(zhì)基礎研究。研究內(nèi)容包括以下幾個方面:
　　 (一)氣滯血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)效應評價體系的建立與應用。
　　 1.以香附四物湯臨床傳統(tǒng)用藥形式-湯劑為研究對象,采用水煎煮的方法進行提取,并對其揮發(fā)性成分進行收集:在強調(diào)湯劑作為方劑整體作用物質(zhì)的基礎上,又采用現(xiàn)代分離技術大孔吸附樹脂法對其不同化合物類型進行純化富集,制備得15個樣品供生物效應評價及成分分析,以期探討生物效應、效應物質(zhì)及其兩者之間的關系

4、。
　　 2.選擇離體器官模型(離體了宮收縮模型)、整體動物模型(原發(fā)性痛經(jīng)模型)對香附四物湯及各分離部位進行生物效應評價,香附四物湯、醇沉上清液部位和60％乙醇洗脫部位均呈現(xiàn)出對子宮收縮的明顯抑制活性。采用HPLC法對60％乙醇洗脫效應部位中主要化學成分進行定量分析,結果分析測定了效應部位中6個主要化學成分(即四氫非洲防己堿、普魯托品、紫堇堿、延胡索乙素、四氫黃連堿、小檗堿)的含量。通過離體子宮收縮模型的效應驗證,表明化合物組

5、能夠較好的代表效應部位的效應,提示香附四物湯治療氣滯血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的效應部位中抑制小鼠離體子宮收縮的主要效應成分主要為生物堿類化合物,小檗堿對縮宮素誘導的離體子宮收縮抑制效應最強。
　　 3.選擇小鼠脾淋巴細胞增殖與轉化實驗對香附四物湯及各分離部位進行免疫相關的生物效應評價,香附四物湯、醇沉上清液部位和30％乙醇洗脫部位具有促進小鼠脾淋巴細胞增殖與轉化作用。采用HPLC法對30％乙醇洗脫效應部位中主要化學成分進行定量分析,結果

6、分析測定了效應部位中4個主要化學成分(即芍藥內(nèi)酯苷,芍藥苷,阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I)的含量。將化合物組與活性部位進行效應驗證,表明化合物組能夠較好的代表效應部位的效應,提示芍藥內(nèi)酯苷,芍藥苷,阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I是該活性部位的主要活性成分,香附四物湯與四物湯在免疫增強活性中有共同的物質(zhì)基礎。
　　 4.選擇急性血瘀大鼠模型從血液流變學、內(nèi)分泌激素等多方面對香附四物湯及分離部位進行生物效應評價,主要研究結果有香附四物湯及其醇溶部位能

7、有效改善急性血瘀SD大鼠全血黏度、血漿黏度、血沉等病理變化,延長TT、APTT,降低纖維蛋白原含量,對卵巢功能也具有一定改善作用,而醇沉部位對血液流變性各項指標影響較弱。
　　 5.通過腦微透析色譜聯(lián)用技術研究香附四物湯對痛經(jīng)模型大鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)的影響,結果表明香附四物湯在下丘腦阻斷5-HT轉變?yōu)?-HIAA。
　　 (二)香附四物湯與基本方用于婦科血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的配伍特點分析。
　　 選擇整體動物模型(氣滯血瘀

8、大鼠模型,血虛小鼠模型,熱板致痛小鼠模型,醋酸致痛小鼠模型,原發(fā)性痛經(jīng)小鼠模型)等從血液流變學、內(nèi)分泌激素、動物行為學等多方面對香附四物湯和基本方進行生物效應評價和比較分析。主要研究結果為:
　　 1.氣滯血瘀SD大鼠模型研究結果表明,香附四物湯能夠明顯改善氣滯血瘀模型大鼠血液流變學指標,而基本方干預的氣滯血瘀模型大鼠血液流變學指標改善不明顯。
　　 2.血虛小鼠模型研究結果表明:香附四物湯干預的血虛小鼠模型改善外周血象

9、作用不明顯,基本方更有利于調(diào)節(jié)機體免疫功能,促進造血功能的恢復。
　　 3.熱板致痛小鼠模型,醋酸致痛小鼠模型和原發(fā)性痛經(jīng)小鼠模型研究結果表明:香附四物湯在這三個模型上表現(xiàn)的牛物效應優(yōu)于基本方,香附四物湯在抑制痛經(jīng)作用中以鎮(zhèn)痛為主。
　　 (三)香附四物湯方藥物質(zhì)基礎研究。
　　 1.香附四物湯組成藥味之一-香附的水溶性成分分離與鑒定,通過色譜分離技術,從香附60％乙醇提取物中分離得到一個新的腦苷,對其波譜數(shù)據(jù)進

10、行分析,該化合物被鑒定為1-O-(β-D-glucopyranosyloxy)-(2S,3R,4E,8Z)-2-[(2'R)-2'-hydroxylignoceranoylamino]-4,8-tetradecene-3-diol,并具有抑制血管平滑肌細胞增殖的作用。
　　 2.采用UHPLC-DAD-ESI-MS法、通過標準化合物對照及質(zhì)譜特征分析對香附四物湯中的主要色譜峰進行了歸屬和指認,分析鑒定了其中包括芳香酸、苯酞類、含

11、氮化合物、萜類、糖等化合物類型的34個化合物,為闡明香附四物湯的效應物質(zhì)提供了依據(jù)。
　　 3.采用HPLC法對香附四物湯醇沉上清部位小分子活性成分進行定量分析,結果分析測定了沒食子酸、綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、咖啡酸、芍藥苷、四氫非洲防己堿、普魯托品、阿魏酸、延胡索乙素、小檗堿等10個化學成分的含量,為進一步闡明活性部位中各成分與藥效相關性研究提供參考。
　　 4.通過苯酚/咔唑-硫酸法測定了香附四物湯醇沉沉淀部位的多糖含量

12、,為明晰部位與藥效相關性研究提供參考。
　　 五、香附四物湯用于模型動物與人體的效應機理與代謝特征研究。
　　 (一)香附四物湯對模型動物與人體的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡指標的影響。
　　 1.通過臨床試驗,得出結論:香附四物湯對氣滯血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)患者有治療作用,血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)生與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡的各因子變化密切相關,香附四物湯對網(wǎng)絡內(nèi)的β-EP、E2、T、外周血象等指標具有調(diào)控作用。
　　

13、2.對模型動物的實驗研究,得出以下結果:香附四物湯(1)在下丘腦阻斷5-HT轉變?yōu)?-HIAA;(2)促進卵巢顆粒細胞的增殖;(3)直接抑制OT誘導的在體/離體子宮強烈收縮,顯著升高痛經(jīng)小鼠子宮組織中NO水平,且降低子宮組織中鈣離子水平,提高SOD酶活力;(4)改善血瘀大鼠血液流變學病理變化,抗凝血酶活性;(5)在內(nèi)分泌系統(tǒng),糾正病理狀態(tài)下機體的E2,P異常水平,抑制COX-2酶活性;(6)在免疫系統(tǒng),促進脾淋巴細胞增殖,抑制LPS誘導

14、的巨噬細胞NO釋放。臨床試驗與模式動物實驗的結果相互補充,證實了課題假說:四物湯活血類方具有特定的配伍關系及內(nèi)在規(guī)律,其治療婦科血瘀證痛經(jīng)是通過共有/各異性效應物質(zhì)對神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡的調(diào)控和/或直接作用于靶器官而實現(xiàn)其整體調(diào)節(jié)作用,達到標本兼治的目的。
　　 (二)香附四物湯用于原發(fā)性痛經(jīng)模型動物的UHPLC-MS代謝組學初步研究。
　　 在縮宮素誘導的原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型中,前列腺素和類花牛酸類物質(zhì)含量升高,溶血磷

15、脂降低,香附四物湯對原發(fā)性痛經(jīng)的抑制作用與LPC代謝通路有關。
　　 (三)香附四物湯在模式動物與人體內(nèi)的代謝過程與特征研究。
　　 1.使用UHPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用技術,通過MetaboLynxTM軟件處理快速分析了香附四物湯醇沉上清部位在大鼠血漿、尿液、膽汁中的代謝物,從香附四物湯給藥后大鼠的尿液、膽汁和血漿中找到45個代謝物,包括羥化、甲基化、磺化、葡糖醛酸化、半胱氨酸化、去甲基化、失氧等多種類型;快速分析

16、了香附四物湯60％乙醇洗脫部位中部分牛物堿在大鼠組織中的代謝組分。從大鼠組織中共鑒定分析了包括原型化合物在內(nèi)的16個成分,從結果可以看出,該部位中的生物堿原型及其代謝物廣泛分布于各組織器官,甲基化、去甲基化、磺化、單葡糖醛酸化、磺化與葡糖醛酸化結合是該部位中生物堿的主要代謝類型;
　　 2.使用UHPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用技術,通過MetaboLynxTM軟件處理快速分析了香附四物湯在人尿液和血漿中的代謝組分,從服用香附四物