hVEGF基因工程生物膜的制備和鑒定.pdf

1、創(chuàng)傷愈合中最關(guān)鍵的過程是創(chuàng)面新生血管的生長,新生的血管床將為創(chuàng)面修復(fù)提供各種營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞因子.加快創(chuàng)傷早期新生血管的生長對(duì)減少瘢痕組織形成和感染的發(fā)生有重大意義,并將最終影響到預(yù)后外觀和肢體功能恢復(fù).該實(shí)驗(yàn)用基因工程方法改造成纖維細(xì)胞,篩選出能夠持續(xù)分泌hVEGF(人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)的細(xì)胞株,將該細(xì)胞種植于合適的細(xì)胞載體,制成基因工程生物膜,為難于愈合創(chuàng)面(如糖尿病性慢性潰瘍)的治療提供了有效方法.該實(shí)驗(yàn)將含有hVEGF的穿梭質(zhì)

2、粒pCDNA3-hVEGF導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞,使周G-418根據(jù)極限稀釋法篩選出7個(gè)單克隆細(xì)胞株.從中挑選出整合有hVEGF基因且表達(dá)hVEGF最高的一個(gè)細(xì)胞克隆在DNA水平,mRNA水平和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行鑒定,同時(shí)使用MTT,雞胚實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性.結(jié)果顯示:PCR和SouthernBlot證明hVEGF基因已整合入NIH-3T3細(xì)胞基因組,RT-PCR和Northem Blot則表明該細(xì)胞株能夠表達(dá)hVEGF-mRN

3、A.hVEGF-ELlsA 證實(shí)在蛋白質(zhì)水平該細(xì)胞株能夠持續(xù)表達(dá)hVEGF個(gè)月以上,并始終保持非常高的水平.在此基礎(chǔ)上,將該細(xì)胞種植于三種生物膜(甲殼素,絲素膜和Biobrane),并比較其在此三種生物膜上的生長情況.結(jié)果顯示:Biobrane為最適支持物.進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn):該工程細(xì)胞不僅可以在Biobrane上良好生長,而且仍舊能夠表達(dá)高水平的hVEGF.同時(shí)繪制了該細(xì)胞在Biobrane上的生長曲線,得到它在Biobrane上生長狀況