抗血小板膜糖蛋白基因工程抗體的制備和性質(zhì)研究.pdf

1、蘇州大學博士學位論文抗血小板膜糖蛋白基因工程抗體的制備和性質(zhì)研究姓名：安廣宇申請學位級別：博士專業(yè)：內(nèi)科血液學指導教師：阮長耿2001.4.1墊坐!：堡墮焦墨宴莖里三堡墊竺墮型魚塑絲墮堡壅一——塑——墨一BL2lrDE3)PlysS中表達了功能分子。SDS—PAGE和Westernblot顯示表達產(chǎn)物的分子量為27000。該融合蛋白除少量為分泌型表達外，主要以包涵體形式存在，表達量占菌體總蛋白的21％，約20mg／L。同時探索了該抗體片

2、段的最佳復性條件。把包涵體形式表達的Sz2l單鏈抗體片段用尿素溶解，經(jīng)過蛋白質(zhì)的體外重折疊復性過程，成功地得到具有活性的單鏈抗體片段。ELISA和Western印跡檢測證實，該墮鏈抗體保留了與血小板特異結(jié)合的能力。四SZ21SeFv的純化和體外性質(zhì)研究通過NiNTA樹脂親和吸附純化，獲得具有活性的高純度單鏈抗體片段，純度達95％以上。流式細胞儀檢測證實該單鏈抗體能與人臍靜脈內(nèi)皮細胞和血小板反應。體外實驗表明，Sz21單鏈抗體能夠抑制AD

3、P誘導的血小板聚集，其抑制能力呈劑量依賴性，其IC。為12ug／mL在濃度為20ug／mL時達到最大抑制率。對花生四稀酸誘導的血小板聚集亦有相似的抑制作用。此外，SZ21單鏈抗體同樣能夠抑制纖維蛋白原與血小板的結(jié)合，顯示了其抗血栓作用。以上結(jié)果表明，制備的基因工程抗體具有原鼠單克隆抗體的抗血栓形成能力，減少了全抗體的人抗鼠抗體反應(HAMA)；同時該小分子抗體片段去除了抗體的Fc段，避免鼠源性單克隆抗體引起血小板嚴重下降的副作用。該單鏈

4、抗體有望用于抗血栓治療。五抗血小板膜糖蛋白單抗sz21嵌合Fab片段基因構建和表達研究利用基因克隆技術，從雜交瘤細胞系SZ21中克隆出輕、重鏈可變區(qū)基因，然后亞克隆到含有人恒區(qū)基因CⅢ和C。的質(zhì)粒pSWlFab中，構建成人一鼠嵌合Fab抗體片段質(zhì)粒pSZ21，在大腸桿菌中表達了可溶性Fab抗體片段。SDSPAGE顯示在分子量(脅)45000處有一誘導條帶，與該嵌合抗體的理論計算值相符。表達量約為800ug／L，ELISA和Western