ECC菌斑生物膜中白色念珠菌的分離鑒定及生物膜形成能力的初步研究.pdf

1、研究表明，與嬰幼兒齲(early childhood caries，ECC)發(fā)生密切相關(guān)的微生物主要有變形鏈球菌、放線菌及乳桿菌等。近年來，白色念珠菌(Candida albicans，C.albicans)與ECC的相關(guān)性及其致齲能力等開始引起學(xué)者們關(guān)注。白色念珠菌的致齲性主要表現(xiàn)為產(chǎn)酸性、耐酸性、粘附性及溶解膠原能力。白色念珠菌可粘附于牙體硬組織表面形成生物膜，是其致齲的首要步驟，并在合適的條件下快速繁殖引起疾病。
　　 目

2、的：通過對(duì)ECC組及無齲組(caries-free，CF)菌斑生物膜中的白色念珠菌進(jìn)行分離純化及鑒定，分析白色念珠菌檢出率與ECC發(fā)生的相關(guān)性，及與齲失補(bǔ)牙數(shù)(decayed-missed-filled teeth，dmft)分級(jí)的關(guān)聯(lián)性；構(gòu)建白色念珠菌體外牙菌斑生物膜模型，觀察白色念珠菌生物膜的結(jié)構(gòu)；比較白色念珠菌臨床菌株的生物膜形成能力，探討白色念珠菌在齲病發(fā)生過程中的作用。
　　 方法：①選取廣州市四所幼兒園363名兒童作

3、為研究對(duì)象，年齡范圍為3-5歲，分為ECC組(n=238)和CF組(n=125)。采集ECC組口腔中齲壞牙體組織及CF組口腔中的齦上菌斑，應(yīng)用科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagar Candida)對(duì)臨床菌株進(jìn)行培養(yǎng)鑒定，并采用革蘭氏染色、芽管試驗(yàn)及厚膜孢子形成試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，獲得純化的白色念珠菌株。②應(yīng)用Pearson x2檢驗(yàn)分析白色念珠菌檢出率與ECC發(fā)生及dmft分級(jí)的關(guān)聯(lián)性。③采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定白色念珠菌生長(zhǎng)光密度(Op

4、tical Density，OD)值，描繪生長(zhǎng)曲線，了解其生長(zhǎng)規(guī)律，為構(gòu)建菌斑生物膜模型奠定基礎(chǔ)。④構(gòu)建白色念珠菌牙菌斑生物膜模型，應(yīng)用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)和熒光顯微鏡觀察生物膜的結(jié)構(gòu)。⑤通過采用平板菌落計(jì)數(shù)法定量檢測(cè)生物膜活細(xì)胞數(shù)目，對(duì)比分析ECC組與CF組臨床菌株的生物膜形成能力。
　　 結(jié)果：①白色念珠菌的檢出率在ECC組中為44.12％，CF組為19.2％，差

5、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ECC組中，男、女生白色念珠菌的檢出率分別為59.69％、34.86％，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CF組中，白色念珠菌檢出率男生為21.13％，女生為18.52％，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②采用Pearsonx2檢驗(yàn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示白色念珠菌檢出率與dmft的分級(jí)具有關(guān)聯(lián)性(P＜0.05)，其關(guān)聯(lián)系數(shù)為0.353。③白色念珠菌起始OD值約0.2時(shí)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在14～3

6、0h之間，其生長(zhǎng)曲線具有遲緩期、對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期。④采用ECC、CF組中的臨床菌株及SC5314構(gòu)建白色念珠菌牙菌斑生物膜模型。應(yīng)用SEM觀察與牙體組織共培養(yǎng)90min的菌株SC5314，發(fā)現(xiàn)其可粘附于牙片，并主要由孢子相細(xì)胞組成，細(xì)胞呈圓形或者橢圓形，直徑約2～4μm，但未見菌絲的形成及其侵入牙本質(zhì)小管。熒光顯微鏡觀察臨床菌株及SC5314在牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)上形成菌斑生物膜的過程：培養(yǎng)4h的生物膜由孢子相細(xì)胞組成，多為散在的單個(gè)細(xì)胞，偶見

7、微菌落；培養(yǎng)24h的生物膜細(xì)胞聚集形成微菌落，少見單個(gè)細(xì)胞；培養(yǎng)48h的生物膜顯示紅色死亡細(xì)胞數(shù)量增加。臨床菌株在牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)上形成的菌斑生物膜均未見菌絲形成。菌株SC5314在牙本質(zhì)上形成的菌斑生物膜可見菌絲形成，而在牙釉質(zhì)上形成的菌斑生物膜則未見菌絲形成。⑤采用方差分析生物膜平板菌落計(jì)數(shù)值，結(jié)果顯示SC5314在不同時(shí)間點(diǎn)及不同附著載體上的生物膜形成能力不同。白色念珠菌接種于牙釉質(zhì)上培養(yǎng)4h、24h及48h的生物膜形成能力不同，且

8、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，白色念珠菌接種于牙釉質(zhì)上培養(yǎng)24h的生物膜形成能力高于48h(P＜0.05)。白色念珠菌接種于牙本質(zhì)上培養(yǎng)4h、24h及48h的生物膜形成能力不同，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，白色念珠菌接種于牙本質(zhì)上培養(yǎng)24h的生物膜形成能力高于48h(P＜0.05)。白色念珠菌接種于牙本質(zhì)上培養(yǎng)24h的生物膜形成能力高于牙釉質(zhì)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑥采用平板菌落計(jì)數(shù)法定量檢測(cè)ECC及CF