基因工程乙肝疫苗的制備

1、基因工程乙肝疫苗的制備基因工程乙肝疫苗的制備【摘要】基因工程乙肝疫苗是通過構(gòu)建含有乙肝表面抗原的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞，制備乙肝病毒表面的有效蛋白。本文主要介紹基因工程疫苗重組酵母乙肝疫苗制備的基本原理和工藝流程，以及乙肝疫苗的純度分析方法?！娟P(guān)鍵詞】乙肝疫苗重組質(zhì)粒工藝流程1.基因工程乙肝疫苗產(chǎn)生背景疫苗是人類目前可以徹底消滅某一疾病的唯一武器，接種疫苗被認(rèn)為是最有效、最經(jīng)濟(jì)的疾病預(yù)防手段?！栋l(fā)展中國家消滅乙型肝炎免疫接種計(jì)劃實(shí)施指南》

2、中指出：“世界上四分之三的人口生活在中或高乙肝流行區(qū)，因此，唯一的策略就是有效地減少乙肝的流行，最終消滅乙肝”世界衛(wèi)生組織肝炎專家及計(jì)劃免疫全球咨詢組認(rèn)為：控制全球乙型肝炎及減少死亡的策略是開展大規(guī)模的嬰兒及學(xué)齡前兒童的乙肝疫苗接種。我國衛(wèi)生部制定的目標(biāo)是從92年開始在全國逐步推行乙型肝炎（HB）計(jì)劃免疫。92年全國共生產(chǎn)血源疫苗1500萬人份，尚不能滿足新生兒接種需要，如考慮其他人群，缺口更大。為了實(shí)現(xiàn)HB計(jì)劃目標(biāo)，進(jìn)一步為控制全球H

3、B做出貢獻(xiàn)，我們必須大規(guī)模提高HB疫苗的產(chǎn)量和進(jìn)一步提高質(zhì)量。血源HB疫苗原料為無癥狀帶毒者的HBsAg陽性血漿。血源價格昂貴，供應(yīng)量有限，采集困難。因此血源疫苗的產(chǎn)量和成本受到原料的限制。利用基因工程重組微生物細(xì)胞表達(dá)HBsAg生產(chǎn)HB疫苗的技術(shù)，原料易得，價廉，適宜進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，有可能大幅度降低成本。2.使用重組酵母的原因和重組酵母構(gòu)建2.1使用重組酵母的原因使用重組酵母進(jìn)行乙肝疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，有如下幾點(diǎn)原因：（1）.酵母對培養(yǎng)

4、基的要求低，價廉易得。（2）.酵母細(xì)胞生長快，故生產(chǎn)率高。（3）.動物細(xì)胞生長慢，容易染菌，對操作要求嚴(yán)。（4）.酵母系統(tǒng)容易放大，動物細(xì)胞系統(tǒng)放大難。2.2重組酵母構(gòu)建HBV只有3200bp，為雙鏈的DNA是一個相當(dāng)小的病毒。其基因組共有四個F，編碼以下一些蛋白：Ce蛋白和prece蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白（L、M、S）。故重組酵母可用以下方法：目的基因分離重組質(zhì)粒的構(gòu)建（切，接）導(dǎo)入酵母細(xì)胞（轉(zhuǎn)）培養(yǎng)酵母細(xì)胞（增）檢測正

5、確表達(dá)目的產(chǎn)物的酵母（檢）（1）.根據(jù)已經(jīng)測定的編碼乙肝病毒表面抗原決定簇基因序列，用化學(xué)合成法直接合成目的基因或者通過鳥槍法克隆目的基因。用識別相同黏性末端的限制性內(nèi)切酶將外源DNA進(jìn)行大量有效的乙肝病毒表面抗原的生產(chǎn)；生物反應(yīng)過程是以生命體的自動調(diào)節(jié)方式進(jìn)行的，多個反應(yīng)像一個反應(yīng)一樣，在單一設(shè)備中進(jìn)行；生產(chǎn)過程中，通常常溫進(jìn)行，操作溫和，不考慮防爆問題；能夠高度選擇性的進(jìn)行復(fù)雜化合物在特定部分的反應(yīng)，如氧化、還原、官能團(tuán)導(dǎo)入；生產(chǎn)過

6、程中考慮防止雜菌的污染。發(fā)酵過程中，可采用分批補(bǔ)料或連續(xù)流加補(bǔ)料以保證最優(yōu)生長和維持細(xì)胞濃度、生長速度和營養(yǎng)供應(yīng)之間的適當(dāng)平衡?？商砑诱T導(dǎo)劑如乳糖到發(fā)酵液中去以誘導(dǎo)可調(diào)節(jié)啟動子的表達(dá)。有人對重組酵母表達(dá)的HBsAg的影響進(jìn)行過研究，發(fā)現(xiàn)在碳源中降低葡萄糖濃度，補(bǔ)充甘油和蔗糖能較明顯地改善比活值和HBsAg的相對濃度。將發(fā)酵前期、中期和后期溫度分別控制在27℃、33℃、25℃；發(fā)酵從pH4.5開始，逐步上升到pH6；以及維持溶氧濃度在最適

7、水平（70%飽和度），都可以提高重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性和HBsAg在發(fā)酵液中的積累。當(dāng)然，需要根據(jù)不同菌種發(fā)酵的最適條件、培養(yǎng)基異同、當(dāng)?shù)貤l件等各種因素適當(dāng)對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行微調(diào)，以保證發(fā)酵的順利高效進(jìn)行。5.2.分離純化和純度測定工藝雖然我們已經(jīng)有從人血中分離純化HBsAg的豐富經(jīng)驗(yàn)，但由于重組酵母表達(dá)的抗原是在細(xì)胞內(nèi)，存在的量相當(dāng)小，僅占酵母蛋白、核酸和脂的5%不到，酵母細(xì)胞和培養(yǎng)基的成分與血漿有很大不同，為了從重組酵母中得到高純度的抗原，有

8、必要研究、探索新的純化工藝。對于血源性乙肝疫苗分離純化的重點(diǎn)是除去活性污染物或使其失活，對于基因工程乙肝疫苗而言是去除細(xì)胞和培養(yǎng)基成分。下圖表示文獻(xiàn)報(bào)道的國外工業(yè)化生產(chǎn)重組酵母乙肝疫苗的工藝路線，可作為技術(shù)開發(fā)的參考。工藝1：細(xì)胞破碎微濾超濾硅膠吸附硫氰酸鹽處理無菌過濾氫氧化鋁共沉淀分裝發(fā)酵結(jié)束后，通過過濾或離心，使酵母與發(fā)酵液分離，然后細(xì)胞通過高壓勻漿機(jī)破碎，釋放出抗原。酵母的細(xì)胞壁較厚，比大腸桿菌難破碎，可在高壓勻漿機(jī)內(nèi)施加幾千個大

9、氣壓力，通過針形閥突然降壓到零，使細(xì)胞破碎。在細(xì)胞破碎前加入蛋白酶抑制劑以防抗原被分解。細(xì)胞破碎后加入表面活性劑使抗原溶解。粗細(xì)胞裂解物用0.2um中空纖維柱進(jìn)行微濾?？乖痛蟛糠值头肿恿克拗骷?xì)胞內(nèi)含物通過濾膜，細(xì)胞碎片被膜攔截。濾液再進(jìn)行超濾，此時抗原被膜攔截而低分子量宿主細(xì)胞內(nèi)含物通過濾膜除去。殘留的表面活性劑通過吸附在一種聚苯乙烯小珠上除去。再用硅膠吸附抗原，用熱硼酸緩沖液洗脫。純化最后一步是用丁基瓊脂糖進(jìn)行疏水層析。純化后的抗原