新生隱球菌通過S100A10影響MMP9侵襲血腦屏障的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　隱球菌(Cryptococcus)系環(huán)境腐生菌，也是重要的機會致病真菌，常在免疫功能低下人群引起感染。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是隱球菌病最主要的臨床表現(xiàn)，其中隱球菌性腦膜炎/腦膜腦炎(Cryptococca meningitis/meningoencephalitis，CME)是其高病死率的最主要病因。強烈的嗜中樞性是隱球菌病的一個顯著特點，有超過90％的隱球菌病侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，但目前其機制不明。血腦屏障便是隱球菌侵襲中

2、樞神經(jīng)系統(tǒng)的必經(jīng)關(guān)卡，所以新生隱球菌侵襲血腦屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）的途徑只能是:或穿過腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞;或穿越細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)。目前有三個機制假說:1.細(xì)胞旁途徑;2.“特洛伊木馬”機制;3.跨細(xì)胞途徑（即內(nèi)皮細(xì)胞胞吞胞吐）。
　　S100A10蛋白是鈣結(jié)合蛋白家族中S100蛋白家族中的一員，存在于很多細(xì)胞的胞漿和胞核中。S100A10蛋白可與膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2)結(jié)合為異四聚體(

3、S100A10)2-(annexinA2)2并作為膜蛋白存在于多種細(xì)胞的細(xì)胞膜上。繼而使纖溶酶原被tPA（組織型纖溶酶原激活劑）、uPA（尿激酶型纖溶酶原激活劑）激活為纖溶酶，同時激活基質(zhì)金屬蛋白酶，降解細(xì)胞基質(zhì)。它與細(xì)胞的胞吞胞吐、物質(zhì)轉(zhuǎn)運等密切相關(guān)。
　　MMP9蛋白是一類結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內(nèi)肽酶MMPs(Matrixmetalloproteinase，MMP)家族中的一員，包括分子量為92kDa的無活性形式Pr

4、o-MMP9和82kDa的活性形式MMP9。體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞并不儲備MMPs，只有當(dāng)需要MMPs的信號傳遞到細(xì)胞后才臨時合成，然后以無活性的酶原形式分泌到胞外。隨后被激活并呈現(xiàn)瀑布效應(yīng)。MMPs與血腦屏障開放有關(guān)，其中MMP-9可分解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ、彈性蛋白、微纖維蛋白、層粘連蛋白、骨連蛋白。
　　針對隱球菌感染血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞后上調(diào)S100A10是否影響MMP9的表達(dá)，本研究進(jìn)行了深入研究，進(jìn)一步驗證MMP9是否在新生隱球菌

5、的嗜中樞性機制中起到一定作用，并探索抑制MMP9來保護(hù)血腦屏障的新方法。
　　研究目的:
　　第一，觀察新生隱球菌通過小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(b.End3)S100A10影響基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)在mRNA水平和細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)水平的表達(dá);第二，沉默小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP9基因后，驗證基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)情況;構(gòu)建該細(xì)胞系體外血腦屏障模型，探究此時新生隱球菌侵襲血腦屏障的能力;第三，探索基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑GM6001

6、對新生隱球菌穿過血腦屏障是否有一定的保護(hù)作用，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究提供體外實驗基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　第一部分:將慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(b.End3)細(xì)胞，分別篩選穩(wěn)定下調(diào)S100A10、MMP9以及空載的細(xì)胞系，分別用熒光顯微鏡和qPCR定性和定量驗證其下調(diào)程度（該部分已發(fā)表）。以新生隱球菌B3501感染由LV-musS100A10-shRNAb.End3和NC b.End3構(gòu)建的簡易體外血腦屏障模型，在mR

7、NA水平和蛋白水平檢測基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)表達(dá)量的差異。
　　第二部分:將LV-musMMP9-shRNA b.End3和NC b.End3分別構(gòu)建transwell體外血腦屏障模型，新生隱球菌B3501感染該模型，檢測其穿透血腦屏障的活菌數(shù)和BBB的完整性。
　　第三部分:基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑在新生隱球菌性腦炎/腦膜炎防治中的作用初步探索。以小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(b.End3)細(xì)胞構(gòu)建體外血腦屏障模型，放置于不同濃

8、度的GM6001環(huán)境中。檢測GM6001作用時，穿過血腦屏障的活性隱球菌數(shù)量以及血腦屏障穩(wěn)定性的改變程度，以探討GM6001對血腦屏障的保護(hù)作用及最佳濃度。
　　結(jié)果:
　　第一部分:成功構(gòu)建了NC b.End3細(xì)胞系、LV-musS100A10-shRNA b.End3細(xì)胞系和LV-musMMP9-shRNA b.End3細(xì)胞系，后兩者M(jìn)MP9基因表達(dá)下調(diào)分別在76％和78.8％。經(jīng)S-N-K檢驗，LV-musS100A1

9、0-shRNA b.End3細(xì)胞系和LV-musMMP9-shRNA b.End3細(xì)胞系與NC組、b.End3組差別有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05，而b.End3組與NC組的MMP9表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（該部分已發(fā)表，見附錄）。
　　NC b.End3組與LV-musS100A10-shRNA b.End3設(shè)置對照實驗，兩組分別與新生隱球菌B3501構(gòu)建相應(yīng)體外血腦屏障感染模型。mRNA水平和細(xì)胞內(nèi)外蛋白水平的檢測發(fā)現(xiàn)，LV-mus

10、S100A10-shRNA b.End3組在S100A10下調(diào)后，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)表達(dá)量與NC b.End3組MMP9表達(dá)量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且均較NC組低。
　　第二部分:LV-musMMP9-shRNA b.End3和空載NC b.End3分別構(gòu)建體外血腦屏障的新生隱球菌感染模型。驗證表明，MMP9下調(diào)后，在mRNA水平和細(xì)胞內(nèi)外蛋白水平分別比較兩組間基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)表達(dá)量的差異，經(jīng)檢

11、驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。
　　在此基礎(chǔ)上，用一定量的新生隱球菌B3501感染相應(yīng)分別構(gòu)建好的兩組transwell體外血腦屏障模型模型，檢測血腦屏障穩(wěn)定性的下降程度和穿透血腦屏障模型的活菌數(shù)，以證明其在不同血腦屏障模型的侵襲能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn):第一，LV-musMMP9-shRNAb.End3所構(gòu)建的血腦屏障模型，其跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(TEER)的變化幅度與NC-b.End3組相比有明顯差異，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。兩組

12、BBB的TEER變化幅度有差異，而由LV-musMMP9-shRNA b.End3所構(gòu)建的血腦屏障模型在經(jīng)歷新生隱球菌侵襲時TEER變化幅度小，穩(wěn)定性更高，完整性更好。第二，體外血腦屏障模型中，NC-b.End3組與LV-musMMP9-shRNA b.End3組的transwell下室內(nèi)新生隱球菌數(shù)目隨時間延長而增多，且兩組各時點菌落負(fù)荷均出現(xiàn)差異，經(jīng)成組T檢驗，P＜0.05，各時點兩組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　第三部分:小鼠

13、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3構(gòu)建血腦屏障模型，放置于不同濃度金屬蛋白酶抑制劑GM6001的微環(huán)境，統(tǒng)計B3501穿過血腦屏障的數(shù)目。結(jié)果提示，GM600110μM處理組，transwell下室的活性菌數(shù)量減少，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　MMP9在新生隱球菌通過細(xì)胞旁途徑穿透血腦屏障過程中起到重要作用，其表達(dá)水平依賴于S100A10的表達(dá)情況。
　　隱球菌嗜中樞感染時，金屬蛋白酶抑制劑可作為一種血腦屏障保