新生隱球菌莢膜相關基因CAP10調控機制研究.pdf

1、新生隱球菌是少數(shù)致病真菌之一，不僅感染免疫抑制病人，也能感染免疫正常人群。主要感染中樞神經系統(tǒng)，最常見的是新生隱球菌性腦膜腦炎，約占隱球菌感染的80％。由于近年來艾滋病的流行及臨床上免疫抑制劑的大量應用，新生隱球菌病的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢。 CAP10是近期才被分離的新生隱球菌莢膜相關基因。閱讀框含2081個bp，編碼582個氨基酸組成的蛋白，73kD大小，實驗證明新生隱球菌丟失CAP10基因，其產莢膜能力喪失；使喪失產莢膜能

2、力的新生隱球菌莢膜缺陷株重新獲得CAP10基因后，其產莢膜能力恢復正常。動物實驗也表明，CAP10基因是毒力所必需。另外發(fā)現(xiàn)，其表達受轉錄因子STE12α的正向調控。 分子和細胞生物學的一個中心問題是：順式作用DNA序列(啟動子、增強子)與反式作用因子如何協(xié)同控制基因的表達。這些相互作用是由轉錄因子或轉錄因子復合物特異結合到上述序列上而介導的，這些元件位于轉錄起始位點的上游。目前尚未見有莢膜相關基因調控機制對莢膜合成影響的報道。

3、 目的 對莢膜相關基因CAP10調控機制作更深入的研究，擬尋找具高啟動活性的調控序列位置，并探討糖類，藥物等對其作用的影響，以期對莢膜基因的形成及表達調控有更進一步的了解，從而豐富對新生隱球菌致病機理的解釋，從另一個角度為抗新生隱球菌病的新藥及臨床治療的研究工作打下基礎。 研究方法與內容 該課題共分為三個部分。 第一部分 用分子克隆的方法構建了含有CAP10編碼區(qū)上游5'側翼序列不同長度片段的質粒

4、重組體，通過基因報告系統(tǒng)篩選出了具啟動活性的CAP10上游啟動序列，從而為進一步研究其調控機制打下基礎；在這一部分中分別采用了兩種基因報告系統(tǒng)：Pcxj18質?！湍副磉_系統(tǒng)及Pcat質粒——哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，以期實驗結果的可靠性。兩種報告基因系統(tǒng)具體步驟如下： 1)Pcxj18質?！湍副磉_系統(tǒng)：用分子克隆方法在Pcxj18質粒上分別接入不同長度的CAP10基因編碼區(qū)上游5'側翼序列、CAT基因、TRP1的終止子序列，

5、構建了重組質粒Pcxjcats951，Pcxjcats500，Pcxjcats390，Pcxjcats303，Pcxjcats202，Pcxjcats102；用化學轉化法分別轉化酵母；轉化子進行PCR鑒定；進行轉化子的蛋白提取，紫外分光光度計蛋白定量，ELISA方法進行CAT活性測定；所有測得的CAT值用蛋白濃度進行校正，利用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以x±s表示，統(tǒng)計方法為各組間的方差分析； 2)Pcat質?！溉閯游锛?/p>

6、胞表達系統(tǒng)：用分子克隆的方法在pCAT-enhancer載體質粒(不含啟動子，但含有CAT報告基因)上接入不同長度的CAP10基因編碼區(qū)上游5'側翼序列，得到重組體Pcat951，Pcat500，Pcat390，Pcat303，Pcat202，Pcat102；用Fugene轉染試劑將這些重組體瞬時轉染至大鼠肝星狀細胞株(nFSC)中，ELISA法測定轉染細胞的CAT的表達水平并比較各重組體的啟動子活性。所有測得的CAT值用β-gal值與

7、蛋白濃度進行校正，利用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以x±s表示，統(tǒng)計方法為各組間的方差分析。 第二部分 用不同濃度的葡萄糖、甘露糖、半乳糖，分別誘導第一部分中已證明具CAT表達活性的轉化子，用ELISA方法檢測CAT表達值，比較各組間CAT表達活性不同，以期比較三種不同糖類對新生隱球菌莢膜相關基因CAP10啟動活性的影響，闡述糖類在CAP10表達調控中的作用。與第一部分相同，為保證實驗結果的可靠性，仍采用兩種基因報告系統(tǒng)來進行

8、實驗。 第三部分用不同濃度的氟康唑、兩性霉素B、氟胞嘧啶，分別誘導第一部分中已證明具CAT表達活性的轉化子，用ELISA方法檢測CAT表達值，比較各組間CAT表達活性不同，以期比較幾種不同的抗真菌藥物對新生隱球菌莢膜相關基因CAP10啟動活性的影響。與第一部分相同，為保證實驗結果的可靠性，仍采用兩種基因報告系統(tǒng)來進行實驗。 研究結果 第一部分：結果表明Pcxjcatt951、Pcxjcatt500、Pcxjcat

9、t390、Pcxjcatt303的轉化子CAT表達量與Pcxjcatt202，Pcxjcatt102轉化子及陰性對照間存在顯著差異(P＜0.01)；Pcxjcatt202、Pcxjcatt102轉化子CAT表達量及陰性對照之間無顯著差異(P＞0.05)；Pcxjcatt951、Pcxjcatt500、Pcxjcatt390、Pcxjcatt303的轉化子CAT表達量間比較無顯著差異(P＞0.05)。 Pcat951、Pcat50

10、0、Pcat390、Pcat303的轉化子CAT表達量與Pcat202，Pcat102轉化子及陰性對照間存在顯著差異(P＜0.01)；Pcat202、Pcat102轉化子CAT表達量及陰性對照之間無顯著差異(P＞0.05)；Pcat951、Pcat500、Pcat390、Pcat303的轉化子CAT表達量間比較無顯著差異(P＞0.05)。 綜合兩種報告基因表達系統(tǒng)得出的結果說明：含CAP10上游303bp，390bp，500bp

11、，951bp的轉化子有明顯的CAT表達活性，與陰性對照有顯著的統(tǒng)計學意義；而含202bp，102bp的轉化子無明顯的CAT表達活性，與陰性對照無顯著的統(tǒng)計學意義。 第二部分：不同濃度的葡萄糖和甘露糖對轉化子CAT的表達強弱無明顯的影響，說明這兩種糖類對CAP10啟動活性無明顯的誘導作用。而不同濃度的半乳糖對轉化子CAT的表達強弱有明顯的影響，說明半乳糖對CAP10的啟動活性有明顯的誘導作用，而且這種正向誘導作用在實驗所用的劑量范

12、圍內具有劑量依賴關系。 第三部分：經方差分析，在同一培養(yǎng)條件下不同濃度的氟康唑、兩性霉素B、氟胞嘧啶對轉化子CAT的表達強弱無明顯的影響，各濃度組間相比無顯著性差異(P＞0.05)。說明這三種抗真菌藥物對CAP10啟動活性無明顯的誘導作用。 結論 1.兩種CAT報告基因表達系統(tǒng)——Pcxj18質?！湍副磉_系統(tǒng)及Pcat質粒——哺乳動物細胞表達系統(tǒng)均可用于新生隱球菌基因啟動子的篩選研究，實驗證明兩者得出基本相同

13、的結論。 2.CAP10基因編碼區(qū)上游5'側翼端-303-0bp，-390-0bp，-500-0bp，-951-0bp均具明顯的啟動活性，各片段間啟動活性無明顯差異，-303bp-0bp是具完整啟動活性的最小單位。-202bp--303bp內含CAP10啟動所必須的序列。 3.葡萄糖和甘露糖對CAP10啟動活性無明顯的誘導作用。半乳糖對CAP10的啟動活性有明顯的誘導作用，而且這種正向誘導作用在實驗所用的劑量范圍內具有劑