大腸桿菌血腦屏障侵襲基因ibeB的功能分析.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文大腸桿菌血腦屏障侵襲基因ibeB的功能分析姓名：趙偉東申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：陳譽(yù)華20040301進(jìn)入真核細(xì)胞并發(fā)揮作用。最近，本實(shí)驗(yàn)室觀察到一個(gè)新的現(xiàn)象：將ibeB基因轉(zhuǎn)染至鼠胚胎干細(xì)胞后可以引起類神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)變化，以及觸發(fā)神經(jīng)干細(xì)胞前體細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白——Nestin的表達(dá)?；诖?，本研究采I鉬gsN轉(zhuǎn)染的方法，利用真核表達(dá)載體，對(duì)ibeB基因在人宮頸癌上皮細(xì)艟(Hela)中的高表達(dá)所

2、產(chǎn)生的影響進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以觀察ibeB基因?qū)ela細(xì)胞生物學(xué)特性的影響并對(duì)IbeB蛋白發(fā)揮作用的分子機(jī)制進(jìn)行了探討。方法l真核表達(dá)載體的構(gòu)建11提取pcDNA3／7C(含有ibeB基因)和Invitrogen公司載體pcDNA3I／HisC質(zhì)粒DNA，將ibeB基因全長(zhǎng)(17kb)定向克隆至pcDNA31／HisC，命名為pcHis—ibeB12雙酶切驗(yàn)證克隆是否成功，將pcHis—ibeB送交測(cè)序，驗(yàn)證i

3、beB基圍讀碼框的正確性13利用QiagenMidirep質(zhì)粒DNA中量提取試劑盒，分別提取pcD—NA3】／HisC和pcHis—ibeB質(zhì)粒DNA2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞21利用Fugene”’6transfeetionreagent，對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)lO一】4天的G418篩選，挑取單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，形成能夠穩(wěn)定傳代的細(xì)胞克隆株2：2利用His—tag的抗體，用Westernblot方法檢測(cè)His6一IbeB融合蛋白的表達(dá)