鏈霉菌LC6和LZ35中兩個(gè)隱性次級代謝基因簇的激活及生物合成研究.pdf

1、天然產(chǎn)物是新藥發(fā)現(xiàn)的源泉，而微生物來源的次級代謝產(chǎn)物又是天然產(chǎn)物最重要的來源之一。微生物次級代謝產(chǎn)物的合成基因通常成簇排列在基因組中，為其編碼產(chǎn)物預(yù)測和生物合成研究提供了便利。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展和基因分析方法的成熟，人們發(fā)現(xiàn)許多放線菌，特別是鏈霉菌中存在豐富的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇，然而僅有一小部分可以與已知代謝物相關(guān)聯(lián)，更多的是功能未知的隱性基因簇，顯示了鏈霉菌巨大的新天然產(chǎn)物合成潛力。
　　本研究論文主要通過基因序列指導(dǎo)的

2、天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)策略，嘗試激活兩條沉默次級代謝基因簇，從而獲得新活性天然產(chǎn)物。具體包括:1）Streptomyces sp.LC6中一個(gè)五酮安莎基因簇的激活及其合成功能探究;2）Streptomyces sp.LZ35中一個(gè)NRPS-FAS雜合基因簇的激活及其異源表達(dá)。
　　安莎霉素是一類以3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)為起始單元的Ⅰ型聚酮類天然產(chǎn)物，主要分布在放線菌中，具有廣泛強(qiáng)效的生物活性。Streptomyces sp.L

3、C6是從廈門紅樹林植物秋茄中分離得到的一株AHBA合酶基因陽性菌，前期研究表明其基因組中包含一個(gè)新型五酮安莎霉素合成基因簇(jlm)，但在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下未能從中分到相應(yīng)的安莎類化合物，提示該基因簇可能處于沉默或低表達(dá)狀態(tài)。本課題對該基因簇開展了以下研究:1）在Streptomyces sp.LC6中分別組成型表達(dá)該安莎基因簇中可能的正調(diào)控基因。本課題組張娟利同學(xué)從SARP組成型表達(dá)突變菌株中，分離獲得了一類具有新穎骨架的五酮型安莎霉素

4、二聚物juanlimycins。2)通過基因敲除和代謝譜比較確證了jlm基因簇負(fù)責(zé)編碼juanlimycins。Jlm包括一套完整的AHBA合成基因(jlmGHIKLMN)、PKS基因(jlmABC)、酰胺合酶基因(jlmD)和其它多個(gè)與調(diào)控和后修飾相關(guān)的基因。3）為了探宄juanlimycins的二聚化機(jī)制，我們將jlm的核心基因(jlm A-E)在AHBA前體供應(yīng)豐富的Streptomyces sp.LZ35中進(jìn)行了異源表達(dá)。HPL

5、C檢測顯示異源表達(dá)突變株有明顯的代謝差異峰出現(xiàn)，但LC-MS檢測結(jié)果顯示該差異峰分子量遠(yuǎn)小于juanlimycins和五酮單體，由于該差異峰產(chǎn)量太低，尚未能鑒定其結(jié)構(gòu)。
　　Streptomyces sp.LZ35是一株海洋放線菌，其基因組中存在一個(gè)隱性NRPS-FAS雜合基因簇has。本課題從調(diào)控基因組成型表達(dá)調(diào)控基因和異源表達(dá)兩方面嘗試獲得該基因簇編碼的新脂肽類化合物:1）在Streptomyces sp.LZ35中組成型表達(dá)

6、has基因簇中分屬IclR和LuxR家族的正調(diào)控基因。IclR家族調(diào)控基因組成型表達(dá)突變株能使培養(yǎng)基變?yōu)槊黠@的淺綠色，HPLC代謝譜比較發(fā)現(xiàn)有明顯差異峰，但產(chǎn)物追蹤分離和結(jié)構(gòu)鑒定顯示差異峰為分支酸降解產(chǎn)物和離子螯合劑，并非預(yù)期的脂肽類化合物。LuxR家族調(diào)控基因組成型表達(dá)突變株的代謝譜與野生型有顯著差異，差異峰與后期通過其它策略獲得的脂氨基酸類化合物一致。2）對has基因簇的核心部分進(jìn)行了DNA拼接(52.4 kb)，但是拼接后的has

7、基因簇導(dǎo)入異源宿主Streptomyces lividans SBT5后，未檢測到異源表達(dá)產(chǎn)物。
　　綜上所述，本論文通過基因組挖掘策略成功激活了鏈霉菌LC6中的沉默的新型五酮安莎霉素合成基因簇和鏈霉菌LZ35中沉默的脂氨基酸合成基因簇，證明了操縱調(diào)控基因表達(dá)是簡單有效的隱性基因簇激活手段，一方面為基因序列指導(dǎo)下的天然產(chǎn)物分離提供了例證，另一方面顯示了鏈霉菌巨大的新天然產(chǎn)物挖掘潛力，為以后人們從隱性基因簇中獲得新天然產(chǎn)物提供了借鑒