BMP4通路下游信號(hào)分子Smad1在肺發(fā)育中作用的研究.pdf

1、肺發(fā)育是一個(gè)由多種生長因子協(xié)同調(diào)控的復(fù)雜過程，分枝化形態(tài)發(fā)生是肺發(fā)育早期的主要過程，初始的氣道組織持續(xù)生長、反復(fù)分支，形成復(fù)雜的樹狀氣道系統(tǒng)，此后，氣道末端膨大成終末囊，再進(jìn)一步發(fā)育形成肺泡結(jié)構(gòu)。與此同時(shí)，肺上皮組織分化形成Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞，分泌表面活性物質(zhì)，并與其下毛細(xì)血管網(wǎng)緊密結(jié)合，形成具有完善功能的氣體交換面。肺發(fā)育的成熟程度決定了早產(chǎn)兒能否存活，另一方面，慢性阻塞性肺病(ChronicObstructivePulmonaryD

2、isease，COPD)導(dǎo)致的進(jìn)行性的肺功能損害，已經(jīng)成為危害老年人健康影響生存質(zhì)量的重要疾病，COPD是美國第四大致死疾病，中國衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒顯示呼吸系統(tǒng)疾病是2003年我國城市居民第三大致死疾病，其中85％以上是與COPD類似的慢性下呼吸道疾病。深入了解肺發(fā)育過程中形態(tài)發(fā)生和功能建成的分子機(jī)制對于人工干預(yù)促進(jìn)早產(chǎn)兒肺發(fā)育成熟，對于研發(fā)修復(fù)病損肺的新的治療方法有重要的意義。 BMP4(Bonemorphogeneticprot

3、ein4)是一種在發(fā)育過程中起重要的生長因子，參與軸向信息的確立和多種器官的形成。BMP4的信號(hào)通過Smad1(Mothersagainstdecapentaplegichomolog1)、Smad5和Smad8這三種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，控制效應(yīng)基因的表達(dá)。肺發(fā)育過程中BMP4始終表達(dá)于發(fā)育中的肺的遠(yuǎn)端，控制肺組織沿遠(yuǎn)近軸的分化，抑制BMP4導(dǎo)致末梢肺組織發(fā)育不良，BMP4調(diào)控肺組織發(fā)育地具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。

4、 本研究從BMP4重要的下游信號(hào)分子Smad1入手，分析了在肺發(fā)育的不同階段Smad1的表達(dá)情況；利用小鼠肺器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头治隽薙mad1在肺分枝化形態(tài)發(fā)生中的作用；利用轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型，特異性的從小鼠胚胎肺上皮組織中敲除包含翻譯起始密碼子的Smad1基因第二外顯子使之失活，分析Smad1在末梢肺組織分化中的作用。 實(shí)驗(yàn)材料及方法1.Smad1在胚胎肺發(fā)育過程中的表達(dá)模式：使用定時(shí)交配的Swiss-Webster小鼠分別

5、在E12.5、E14.5、E16.5和E18.5取胚胎，分離胚胎肺，一部分組織用4％多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片，用免疫熒光和免疫組化的方法檢測在不同發(fā)育階段Smad1的表達(dá)模式，以平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白為標(biāo)志，用免疫熒光的方法與Smad1共染色，確定Smad1陽性細(xì)胞的類型。另一部分組織迅速冷凍保存，隨后用RIPA(Radioimmuneprecipitationassay)buffer裂解，Western-ECL檢查Smad1的表

6、達(dá)水平。 2.Smad1在肺分枝化形態(tài)發(fā)生中的作用：使用定時(shí)交配的Swiss-Web-ster小鼠，取E11.5小鼠胚胎，分離胚胎肺。試驗(yàn)組使用Smad1反義寡核苷酸40μM處理4天，每兩天換一次培養(yǎng)液，對照組使用相同濃度的Smad1正義寡核苷酸，同時(shí)設(shè)立一組正常的器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組，每組10個(gè)胚胎肺。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后拍照并沿每一肺器官培養(yǎng)物的外緣計(jì)數(shù)氣道末端分枝數(shù)，TTEST分析，收集到的肺器官培養(yǎng)物固定包埋切片，PCNA(Proli

7、feratingcellnuclearantigen)染色?；蛄呀夥纹鞴倥囵B(yǎng)物，提取總RNA，Real-timePCR鑒定末梢肺組織分化標(biāo)志分子SP-C(SurfactantassociateproteinC)和近端肺組織分化標(biāo)志分子CC10(Claracellprotein10)的表達(dá)。 3.自發(fā)育中的小鼠胚胎肺上皮組織中敲除Smad1對肺發(fā)育的影響：使用基因型為SP-C-rtTA-/tg、(tetO)7-CMV-Cre/t

8、g和Smad1loxp/loxp的轉(zhuǎn)基因鼠，交配得到基因型為SP-C-rtTA-/tg/(tetO)7-CMV-Cretg/tg/Smad1+/loxp的雄性實(shí)驗(yàn)鼠，與基因型為SP-C-rtTA-/-/(tetO)7-CMV-Cre-/-/Smad1loxp/loxp的雌性實(shí)驗(yàn)鼠交配。從E8.5開始，在食物和飲水中加入Doxycycline誘導(dǎo)至試驗(yàn)取材之時(shí)。取特定發(fā)育階段的胚胎肺，以SP-C-rtTA-/-/(tetO)7-CMV-C

9、re-/lg/Smad1+/loxporloxp/loxp的野生型小鼠胚胎肺為對照，固定、切片、HE染色，或分離總RNA。免疫組化或Real-timePCR分析特定的胚胎肺發(fā)育調(diào)控分子及肺組織分化的標(biāo)志分子的表達(dá)變化，收集E18.5轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎肺的標(biāo)本，提取總RNA，用Affymetrix的MouseGenome4302.0Array表達(dá)芯片分析轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎肺整體基因表達(dá)水平的改變。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.Smad1在小鼠胚胎肺發(fā)育

10、過程中的表達(dá)模式：Smad1在胚胎肺發(fā)育過程中始終表達(dá)于末梢肺組織，在E12.5，Smad1主要表達(dá)于胚胎肺的上皮組織中，此時(shí)間質(zhì)中也有少量細(xì)胞表達(dá)smad1。和E12.5相比，E14.5時(shí)，上皮組織中smad1的表達(dá)減少。E16.5以后，Smad1主要存在于間質(zhì)中。胚胎肺發(fā)育早期(E12.5和E14.5)Smad1的表達(dá)水平高于胚胎肺發(fā)育晚期(E16.5和E18.5)。免疫熒光共染色結(jié)果顯示，在E16.5，一部分Smad1和平滑肌肌動(dòng)

11、蛋白被同時(shí)定位于氣道和血管外側(cè)的平滑肌細(xì)胞或間質(zhì)中的myofibroblast細(xì)胞中。 2.Smad1在肺分枝化形態(tài)發(fā)生中的作用：Smad1反義寡核苷酸使小鼠肺器官培養(yǎng)物Smad1的表達(dá)降低。肺分枝化形態(tài)發(fā)生被顯著抑制，末端分枝數(shù)下降了約20％。PCNA染色顯示氣道上皮組織細(xì)胞增殖受到了抑制。肺末梢分化標(biāo)志分子SP-C和近端標(biāo)志分子CC10表達(dá)也顯著降低。在氣道上皮組織中過量表達(dá)Smad1不能促進(jìn)肺的分枝化形態(tài)發(fā)生。

12、 3.小鼠肺上皮組織中Smad1在肺發(fā)育中的作用：Smad1對于小鼠胚胎肺的正常發(fā)育的各個(gè)階段都是必不可少的，自發(fā)育中的小鼠肺上皮組織中同時(shí)敲除兩個(gè)Smad1等位基因的第二外顯子所得純合體(Smad1△/△)新生小鼠的肺發(fā)育不良，呼吸困難，身體青紫，因呼吸衰竭在半小時(shí)內(nèi)死亡，尸檢發(fā)現(xiàn)肺不能張開。即使在E17.5開始用Doxycycline誘導(dǎo)敲除Smad1基因的第二外顯子，仍可導(dǎo)致新生鼠死亡。 對誘導(dǎo)至E18.5的轉(zhuǎn)基因小鼠胚

13、胎肺的分析顯示，Smad1△/△型小鼠胚胎的肺重量與體重的比值明顯低于沒有發(fā)生基因敲除的對照組胚胎小鼠。對HE染色的圖像分析結(jié)果顯示，E18.5的Smad1△/△型胎鼠肺切片中氣道等空隙的面積的百分比明顯高于對照組胎鼠，提示存在肺遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，這可能是由于分枝化形態(tài)發(fā)生不良造成的。免疫組化顯示在E18.5的肺組織切片中Ⅱ型上皮細(xì)胞的標(biāo)志分子SP-C(SurfactantassociateProteinC)染色信號(hào)顯著降低，Real-

14、timePCR結(jié)果與免疫組化的結(jié)果一致，SP-C、Aqp5等Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞的標(biāo)志分子表達(dá)水平顯著降低。遠(yuǎn)端氣道上皮細(xì)胞分化不良。HE染色顯示近端氣道結(jié)構(gòu)正常，免疫組化顯示近端氣道分子標(biāo)志β-tubulin表達(dá)模式正常，僅存在于近端氣道。兩種轉(zhuǎn)錄因子TTF1和Foxa2的表達(dá)模式顯著改變，與對照組胚胎鼠肺相比末梢肺組織中，TTF1表達(dá)下降，F(xiàn)oxa2表達(dá)升高?；蛐酒治鼋Y(jié)果顯示，與E18.5對照組胎鼠相比Smad1△/△型小鼠胚胎肺

15、SP-A、Aqp5以及許多與合成肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)的參與脂類代謝調(diào)控的基因、一些參與免疫調(diào)控的基因以及對抗外界不利環(huán)境因素的基因表達(dá)降低或升高兩倍以上。氣道上皮組織中的Smad1可能存在劑量效應(yīng)，僅敲除一個(gè)Smad1等位基因的第二外顯子的雜合體(Smad1△/+)新生小鼠也顯示與Smad1△/△型小鼠相似的表現(xiàn)型，同樣表現(xiàn)出呼吸困難，身體青紫，但癥狀要輕一些，通?？纱婊?-5小時(shí)。 結(jié)論1.胚胎肺發(fā)育過程中Smad1以一種動(dòng)