Notch信號(hào)通路在肺間質(zhì)纖維化EMT中的作用研究.pdf

1、目的：探討Notch信號(hào)通路特異性抑制劑DAPT抑制此通路前后，在肺上皮細(xì)胞中Notch信號(hào)的激活受體Notch1、配體Jagged1；上皮細(xì)胞標(biāo)記因子E鈣粘素；間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白a-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)變化，從而探索Notch信號(hào)通路在肺纖維化上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）中的作用。進(jìn)而為肺纖維化發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供新的線索。
　　方法：(1)用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肺上皮細(xì)胞株A

2、549細(xì)胞，并等量分組處理，空白對(duì)照組，TGF-βl組，TGF-βl+DAPT組，DAPT組。48小時(shí)后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。(2)細(xì)胞免疫熒光雙染技術(shù)檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白 E鈣粘素和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白a-SMA的表達(dá)。(3) western blotting檢測(cè)蛋白E鈣粘素、a-SMA、Notch1和Jagged1的表達(dá)。(4)熒光定量PCR法檢測(cè)相關(guān)蛋白的mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：TGF-βl可

3、使肺上皮細(xì)胞由不規(guī)則多邊形變成梭形，且細(xì)胞間連接減少，而DAPT則可減輕或逆轉(zhuǎn)這一改變。(2)細(xì)胞免疫熒光雙染顯示：TGF-βl可使E-鈣粘素表達(dá)降低甚至消失，而a-SMA表達(dá)大大增加；同時(shí)加入DAPT則可抑制這一轉(zhuǎn)化，同TGF-β1單獨(dú)作用組相比E-鈣粘素表達(dá)增加，而a-SMA表達(dá)降低；DAPT單獨(dú)作用組與空白對(duì)照組這兩種蛋白表達(dá)大致相同。(3) western blotting結(jié)果顯示：TGF-β1組中α-SMA蛋白、Notch1蛋

4、白和Jagged1蛋白的表達(dá)量較正常組、TGF-β1+DAPT組及DAPT單獨(dú)作用組明顯增加（p<0.05），而E-鈣粘素的表達(dá)量較正常組、TGF-β1+DAPT組及DAPT單獨(dú)作用組明顯減少（p<0.05），且這些蛋白在正常對(duì)照組與DAPT組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。(4)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果示：與空白對(duì)照組相比較， TGF-β1組E-鈣粘素mRNA在48h表達(dá)明顯減少(p<0.05)；a-SMA、Notch1和Jagg

5、ed1mRNA在48h后則明顯增加(p<0.05)；TGF-β1+DAPT組，A549細(xì)胞E-鈣粘素在48h，較TGF-β1組明顯增加(p<0.05)、a-SMA、Notch1和Jagged1 mRNA較TGF-β1組明顯減少(p<0.05)，兩者的表達(dá)都接近空白對(duì)照組；DAPT單獨(dú)作用組， E-鈣粘素、a-SMA、Notch1和Jagged1 mRNA在48h表達(dá)均接近空白對(duì)照組(p>0.05)。
　　結(jié)論：(1)TGF-βl可

6、以誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)化過(guò)程中a-SMA mRNA和蛋白表達(dá)增高，而E-鈣粘素表達(dá)降低。(2)TGF-β1可使Notch信號(hào)通路的受體Notch1及配體Jagged1 mRNA和蛋白表達(dá)增高，在一定程度上激活Notch信號(hào)通路。(3)Notch信號(hào)通路特異性抑制劑 DAPT可以抑制肺上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，下調(diào) a-SMA、Notch1、Jagged1 mRNA和蛋白的表達(dá)，而上調(diào)E-鈣粘素的表達(dá)。(4)Notch信號(hào)通路可