BMP4-Smad信號通路在小鼠原始卵泡卵母細胞凋亡中的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景及意義：人類卵巢內(nèi)的原始卵泡池形成于胚胎發(fā)育晚期或出生前，它提供育齡婦女全部的卵母細胞總數(shù)，一旦形成便不可更新再生，原始卵泡最初形成的數(shù)量達數(shù)百萬，但隨著個體發(fā)育，只有極少部分的卵泡能最終發(fā)育成熟，而99％以上最終都閉鎖退化，原始卵泡的維持是卵泡早期發(fā)育過程中關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，其機制也一直是生殖生物學(xué)的研究熱點。原始卵泡的儲備數(shù)量及其閉鎖程度都直接影響雌性哺乳動物的生殖能力及生育壽命，一旦卵泡的儲備耗竭過早過快，便會導(dǎo)致卵巢早衰(pr

2、ematureovarianfailure，POF)，繼而引發(fā)內(nèi)分泌失調(diào)和不孕。因此，研究原始卵泡的凋亡及其調(diào)節(jié)機制，能夠更深入地了解雌性哺乳動物的生殖機理，而且對臨床不孕癥和卵巢早衰的診斷、治療具有重要的理論和實際意義。
　　原始卵泡是處于休眠狀態(tài)的卵泡，一旦啟動便是一個不可逆的連續(xù)的分化發(fā)育過程，絕大部分在此過程中途閉鎖退化，少部分成為優(yōu)勢卵泡，使卵子成熟并排放。在卵泡發(fā)育的早期階段（包括原始卵泡階段、初級卵泡階段和小竇前卵泡

3、階段），閉鎖是先由卵母細胞的凋亡啟動的，繼而是顆粒細胞的凋亡。而卵母細胞的凋亡機制現(xiàn)尚不完全清楚，最近研究已證實，基質(zhì)細胞和顆粒細胞分泌產(chǎn)生的細胞因子對原始卵泡卵母細胞的凋亡發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bonemorphogeneticprotein-4，BMP4)是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowthfactorβ，TGF-β)超家族的成員，近年來隨著進一步深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP4在卵巢組織內(nèi)

4、通過局部的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)實現(xiàn)對卵泡的生長、發(fā)育、存活以及雌孕激素分泌的調(diào)節(jié)。最近的研究發(fā)現(xiàn)BMP4參與原始卵泡卵母細胞存活的調(diào)控，但其具體的作用機制尚不清楚，本課題探討B(tài)MPs家族經(jīng)典的信號傳導(dǎo)途徑BMP4/Smad信號通路在小鼠原始卵泡卵母細胞凋亡中的作用及其作用機制。
　　本研究通過取3日齡雌性昆明小鼠原始卵泡卵母細胞進行體外培養(yǎng)，利用TUNEL、免疫組織化學(xué)染色、實時定量PCR、WesternBlot、mRNA干擾、sohlh

5、2過表達質(zhì)粒等實驗技術(shù)，檢測了BMP4在卵母細胞存活中的作用，探討其可能的作用機制;該研究結(jié)果不僅有助于揭示原始卵泡凋亡的分子調(diào)控機制，而且可以為充分利用卵巢內(nèi)龐大的卵泡資源，臨床上治療不孕癥和卵巢早衰提供實驗依據(jù)和理論支持。
　　研究方法：1、檢測BMP4/Smad信號通路在小鼠原始卵泡卵母細胞凋亡中的作用取出生后3天的昆明小鼠卵巢，分離并用差異貼壁法純化卵母細胞，并進行原代培養(yǎng)。將純化得到的卵母細胞分成3組:正常對照組(Con

6、組)、添加重組BMP4組(BMP4組)、添加BMP4和BMP4抑制劑Dorsomorphin組（BMP4+抑制劑組），BMP4的終濃度為50μg/L，Dorsomorphin的終濃度為2μmol/L。采用TUNEL法對比三組卵母細胞凋亡所占比例的差異，以檢測BMP4對卵母細胞凋亡的影響;通過免疫組織化學(xué)染色與實時熒光定量PCR法檢測BMP4對卵母細胞中p-Smadl/5/8、sohlh2、c-kit及foxo3a表達的影響。
　　

7、2、探討B(tài)MP4/Smad信號通路在小鼠原始卵泡卵母細胞凋亡中的作用機制
　　(1)采用RNA干擾技術(shù)，分為①siCon;②siCon+BMP4;③siSohlh2;④siSohlh2+BMP4四個組，細胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。TUNEL法檢測四組卵母細胞凋亡所占比例的差異，采用免疫組織化學(xué)染色法、Westernblotting與實時熒光定量PCR法檢測Sohlh2、c-kit及p-Foxo3a基因在四組細胞中的蛋白水平及mRN

8、A水平的表達差異及變化規(guī)律。(2)轉(zhuǎn)染sohlh2質(zhì)粒和加Akt抑制劑LY294002處理，將小鼠sohlh2基因序列克隆入質(zhì)粒pCAG-puro，以建立sohlh2過表達質(zhì)粒pSohlh2。細胞轉(zhuǎn)染后，分別在下述4組條件下進行培養(yǎng):①空質(zhì)粒+Con組;②sohlh2質(zhì)粒+Con組;③LY294002+Con組;④sohlh2質(zhì)粒+LY294002組，LY294002的使用終濃度為25μmol/L。用TUNEL法檢測以上四組卵母細胞凋亡

9、比例的差異，Westernblotting檢測c-kit及p-Foxo3a基因蛋白水平的表達在四組細胞中的差異及規(guī)律。
　　結(jié)果：
　　1、(1)TUNEL結(jié)果顯示，卵母細胞培養(yǎng)48h后，BMP4組凋亡細胞所占比例明顯低于Con組和BMP4+抑制劑組，差異有顯著意義(P＜0.05)，Con組和BMP4+抑制劑組相比無顯著性差異。(2)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，卵母細胞分組培養(yǎng)48h后，BMP4組細胞核內(nèi)p-Smad1/5/8

10、的陽性表達顯著高于Con組和BMP4+抑制劑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);Sohlh2的表達主要分布于卵母細胞的細胞核和細胞質(zhì)內(nèi)，Sohlh2在BMP4組的陽性表達明顯高于Con組和BMP4+抑制劑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);c-kit主要表達于卵母細胞的細胞質(zhì)和細胞膜，而細胞膜的陽性著色更加明顯，c-kit的陽性表達在BMP4組也高于Con組和BMP4+抑制劑組，差異有顯著意義(P＜0.05);卵母細胞胞核內(nèi)Foxo

11、3a的陽性表達BMP4組明顯低于Con組和BMP4+抑制劑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3)實時熒光定量PCR結(jié)果表明，培養(yǎng)48h后BMP4組卵母細胞的sohlh2和c-kit基因表達明顯高于Con組和BMP4+抑制劑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而foxo3a在三組間的表達無明顯差異。
　　2、(1)卵母細胞轉(zhuǎn)染sohlh2siRNA24h后，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，sohlh2siRNA1、sohlh2s

12、iRNA2為有效的sohlh2siRNA，其中sohlh2siRNA1的干擾效果尤為明顯，因此選sohlh2siRNA1為作用的siRNA。TUNEL結(jié)果顯示，相較于siCon組，siCon+BMP4組卵母細胞凋亡比例顯著減少(P＜0.05)，siSohlh2組凋亡的卵母細胞比例增加，差異有極顯著意義(P＜0.01);siSohlh2+BMP4組卵母細胞凋亡數(shù)量高于siCon+BMP4組，差異有極顯著意義(P＜0.01)。免疫組織化學(xué)結(jié)

13、果顯示，相較于siCon組，siSohlh2組Sohlh2和c-kit的陽性著色強度、陽性著色細胞比例均明顯降低(P＜0.05)，siCon+BMP4組Sohlh2和c-kit的陽性表達升高，差異有顯著意義(P＜0.05)，siSohlh2+BMP4組Sohlh2和c-kit的蛋白表達水平低于siCon+BMP4組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與siCon組相比，siSohlh2組Foxo3a的入核比例明顯升高(P＜0.05)，卵

14、母細胞胞核內(nèi)Foxo3a的陽性表達siSohlh2+BMP4組顯著高于siCon+BMP4組(P＜0.01)。Westernblotting結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果相一致，轉(zhuǎn)染sohlh2siRNA后，Sohlh2、c-kit及p-Foxo3a蛋白表達量明顯降低，siCon+BMP4組相較于siCon組明顯增加，且顯著高于siSohlh2+BMP4組，但各組間總Foxo3a蛋白的表達并無明顯差別。qRT-PCR結(jié)果顯示，sohlh2和c-

15、kitmRNA的表達水平相較于siCon組，siSohlh2組明顯降低(P＜0.01)，siCon+BMP4組顯著升高(P＜0.05)，siSohlh2+BMP4組明顯低于siCon+BMP4組(P＜0.05)。(2)轉(zhuǎn)染sohlh2質(zhì)粒和加Akt抑制劑LY294002處理后，TUNEL結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒組比較，凋亡的卵母細胞數(shù)量sohlh2質(zhì)粒組顯著減少(P＜0.05)，添加LY294002后明顯增加(P＜0.05);sohlh2質(zhì)粒

16、+LY294002組卵母細胞凋亡比例顯著高于sohlh2質(zhì)粒組(P＜0.05)。Westernblotting結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染sohlh2質(zhì)粒后，c-kit蛋白表達水平明顯升高，添加LY294002并不影響其表達;各組間總Foxo3a表達無明顯差異，而其磷酸化水平卻有明顯差別，sohlh2質(zhì)粒組明顯高于空質(zhì)粒組，添加LY294002組顯著低于非添加組。
　　結(jié)論：
　　1.激活BMP4/Smad信號通路可抑制卵母細胞的凋亡;<