G-CSF對壓力超負荷下小鼠心室重構(gòu)和心力衰竭的影響.pdf

1、臨床研究顯示,心臟肥大不僅是心臟對各種刺激的代償反應,而且是心臟病發(fā)病和死亡的獨立危險因素,是心力衰竭,心源性猝死的最常見原因,許多心血管疾病如高血壓、瓣膜病、心肌梗死和肥厚型心肌病等均伴有心臟肥大,同時許多內(nèi)在的和外在的刺激如內(nèi)分泌失調(diào)、缺血、神經(jīng)體液因子和細胞因子等都可以誘導心臟肥大,其特征是心臟肥厚,心肌細胞排列紊亂和間質(zhì)纖維化?，F(xiàn)在認為心肌長期負荷過度是引起心臟肥大的主要原因,其發(fā)生機制十分復雜,血管緊張素Ⅱ的升高,心肌肥大肽的

2、產(chǎn)生,膠原改建的直接作用以及前后負荷介導的機械牽拉、熱休克蛋白的調(diào)控保護等,都是心臟肥大必然的和必要的發(fā)病機制[1～4],其中機械負荷是一個很重要的激發(fā)因素。一般的觀點認為心肌細胞是終末分化的細胞,出生后不久即失去了增殖的能力,因此,當心臟處于血流動力學超負荷壓力下時,心肌細胞數(shù)量并沒有增加而體積增大,產(chǎn)生適應性心肌肥厚增加收縮力,減小室壁張力以對抗增加的負荷,但隨著負荷的持續(xù)增加,出現(xiàn)失代償,即非心肌細胞數(shù)量增加并且產(chǎn)生許多細胞外基質(zhì)

3、蛋白如膠原和纖維,從而發(fā)生左心室重構(gòu),最終導致心臟的功能失調(diào)。長期的心臟肥大可導致許多心臟疾病如擴張型心肌病、充血性心衰、心肌梗死、心律失常和心源性猝死。目前臨床上對于心臟肥大的治療仍缺乏有效的手段。雖然心內(nèi)科治療方法多樣,藥物繁多,但是總體療效并不滿意,主要是因為對于心臟肥大的病理生理過程及其產(chǎn)生的分子機制認識不充分,因此,確定心臟肥大的分子機制非常重要,將有助于我們找到預防和治療的有效措施。
　　 粒細胞集落刺激因子(gra

4、nulocytecolony-stimulatingfactor,G-CSF)是一個25kDa的糖蛋白,由于其能有效地誘導動員骨髓干細胞包括造血干細胞,間充質(zhì)細胞和內(nèi)皮祖細胞入血,臨床上最初用來治療中性粒細胞減少和在骨髓移植方案中,近來許多動物研究證實其在心肌梗死等缺血引起的心力衰竭的預防保護中具有重要作用,能改善心功能,縮小梗死面積,其主要機制就是G-CSF能誘導梗死心臟的血管新生,甚至有小部分動員的骨髓干細胞在心臟微環(huán)境下轉(zhuǎn)化為心肌

5、細胞的報道,雖然對此觀點學術(shù)界還有爭論,但G-CSF動員骨髓中干細胞至外周血使其“募集”到心臟梗死區(qū),促進血管新生,改善心肌重構(gòu)的作用是明確的。最近研究發(fā)現(xiàn)G-CSF對心肌細胞具有直接保護作用,其主要機制是G-CSF通過直接作用于心肌細胞上的受體Jak/Stat系統(tǒng),抑制心肌細胞凋亡,促進其生存,這也是在急性心肌梗死中G-CSF改善心功能的重要機制,這提示我們G-CSF可能對非缺血性心臟病如壓力超負荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭也有保護作用

6、。這方面的研究很少,曾有類似報道G-CSF可以減輕阿霉素誘導的心肌病的Fas蛋白表達,抑制心肌細胞凋亡,保持心肌超微結(jié)構(gòu)的完整,最終改善心功能,其治療機制與心肌梗死模型一致,G-CSF能逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的失活,且G-CSF的這種有益作用在心肌病已經(jīng)形成后仍然有效。因此本實驗旨在研究G-CSF對壓力超負荷引起的非缺血性心室重構(gòu)及心力衰竭的影響,探究其可能的作用機制,為臨床治療高血壓性心肌肥厚和心力衰竭提供新的思

7、路。
　　 目前國內(nèi)國外均趨于利用小鼠壓力超負荷模型來研究從心臟肥大逐漸向心力衰竭轉(zhuǎn)變的病理生理和分子機制,故首先探討如何在短時間內(nèi)建立壓力超負荷模型,應用此類模型揭示心臟肥大的內(nèi)在分子機制,是具有重要意義的研究課題。
　　 第一部分
　　 壓力超負荷后心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因小鼠的生物學特性觀察
　　 目的:探索在短時間內(nèi)建立小鼠心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因后壓力超負荷模型,為深入研究心臟肥大的分子機制提供可靠的實驗對象。方法:雄

8、性C57BL/6小鼠隨機分為升主動脈縮窄組(手術(shù)組)和同期假手術(shù)組(對照組),手術(shù)組根據(jù)暫時阻斷主動脈血流5s、10s、30s同時左心腔內(nèi)分別注射Ad-LacZ或PBS后又分為LacZ組和PBS組,觀察術(shù)后4周不同時間小鼠體重、頸動脈血壓和心臟超聲等變化。HE染色和X-gal染色分別觀察心肌肥厚情況和基因轉(zhuǎn)染情況。結(jié)果:手術(shù)成活率88.8％。升主動脈縮窄小鼠的血壓較對照組明顯升高。縮窄術(shù)后2周心肌明顯肥厚,4周時出現(xiàn)失代償性心力衰竭。X

9、-gal染色顯示阻斷血流5s以上心臟有藍染,但10s、30s之間無明顯區(qū)別。結(jié)論:該方法簡單有效,重復性好,可在短時間內(nèi)建立小鼠心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因和壓力超負荷心肌肥厚模型,為心臟肥大的深入研究提供可靠的實驗對象。左心室心腔直接注射轉(zhuǎn)染Ad-LacZ基因同時阻斷升主動脈血流10s以上可以使目的基因有較好的表達。
　　 第二部分
　　 G-CSF對壓力超負荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭的影響
　　 目的:探討粒細胞集落刺激因子

10、(granulocytecolony-stimulatingfactor,G-CSF)對壓力超負荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭發(fā)生發(fā)展的影響及其機制。方法:10～12周齡雄性C57BL/6小鼠86只,隨機分成7組并給予相應干預:PBS組小鼠(PBS組)、替米沙坦組小鼠(ST組)、G-CSF(A)組小鼠(GA組)、G-CSF(B)組小鼠(GB組)、G-CSF+替米沙坦組小鼠(GT組)、替米沙坦+G-CSF組小鼠(TG組)和假手術(shù)組小鼠(Sha

11、m組)。小鼠經(jīng)縮窄升主動脈后,在不同時間皮下注射G-CSF或(和)替米沙坦,每周做心臟超聲檢測心臟功能和形態(tài)變化,分別于第1周、2周和4周末測量右側(cè)頸動脈壓后取材,用HE染色、Masson三色染色觀察心臟形態(tài)變化,用Westernblotting檢測血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)和RT-PCR檢測缺氧誘導因子1(hypoxia-induciblefactorl,HIF-1)、

12、p53mRNA的表達情況。結(jié)果:(1)在0d-14d,縮窄升主動脈的小鼠心室壁厚度值逐漸升高達高峰,14d-28dPBS組厚度逐漸降低,同時伴有左室射血分數(shù)的下降,而給予G-CSF皮下注射的小鼠未見有降低,也未見有射血分數(shù)的下降;(2)同PBS組比較,VEGF蛋白、HIF-1mRNA表達在給予G-CSF皮下注射的小鼠顯著升高,而p53mRNA表達、心臟纖維化程度和死亡率在給予G-CSF組顯著降低。結(jié)論:G-CSF通過調(diào)控血管新生,改善了

13、壓力超負荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭,其中調(diào)控HIF-1的表達可能起著重要的作用。
　　 結(jié)論
　　 1.利用左心室心腔內(nèi)直接注射后縮窄升主動脈的方法可在短時間內(nèi)建立小鼠心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因和壓力超負荷模型,左心室心腔直接注射轉(zhuǎn)染Ad-LacZ基因同時阻斷升主動脈血流10s以上可以使目的基因有較好的表達;
　　 2.G-CSF通過調(diào)控血管新生,改善了壓力超負荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭,其中調(diào)控HIF-1和p53的表達可能起

14、著重要作用。
　　 潛在價值和創(chuàng)新點
　　 1.首次利用腺病毒載體成功將目的基因轉(zhuǎn)染入小鼠心肌細胞建立了轉(zhuǎn)基因小鼠模型;
　　 2.在轉(zhuǎn)基因基礎(chǔ)上證實經(jīng)升主動脈縮窄可在短時間內(nèi)建立心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因小鼠壓力超負荷模型,并應用此模型成功模擬了壓力超負荷下從心臟肥大逐漸向心力衰竭轉(zhuǎn)變的病理生理過程,為揭示心臟肥大的內(nèi)在分子機制提供了可靠的實驗對象
　　 3.發(fā)現(xiàn)G-CSF可能通過調(diào)控HIF-1和p53的表達,促進心