一種可轉(zhuǎn)移的重組工程系統(tǒng)pYM-Red的建立及研究.pdf

1、Recombineering(重組工程)是近年來興起的一項新型基因操作技術(shù)。與傳統(tǒng)的遺傳工程技術(shù)相比，重組工程不需要限制酶和連接酶，僅需要用PCR方法合成線性DNA打靶分子，在大腸桿菌體內(nèi)的噬菌體重組酶作用下，對大腸桿菌染色體DNA或者攜帶大分子基因組DNA序列的BAC/PAC質(zhì)粒進(jìn)行精確的修飾。該項技術(shù)為基因功能研究以及細(xì)菌遺傳學(xué)和疫苗研究開辟了另人激動的新技術(shù)途徑。 本研究用Gap-repair體內(nèi)亞克隆的方法，將λ噬菌體左

2、向操縱子中自exo到cI857長約6.7kb的DNA片斷克隆到低拷貝質(zhì)粒pACYC184中，構(gòu)建了一種新型、高效的重組工程系統(tǒng)pYM-Red。該系統(tǒng)保留了λ噬菌體Red重組酶受嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的特點，又可以在不同的宿主菌間轉(zhuǎn)移，應(yīng)用范圍比較廣泛。pYM-Red的重組效率比pBR322-Red和pKD46分別高5～6倍。 為了探討Red重組酶基因調(diào)控與功能的關(guān)系，用單鏈DNA重組方法，對DY330染色體PL操縱子上的DNA序列進(jìn)行了逐段缺

3、失，建立了3個突變體菌株。與原始DY330菌株相比，這3個突變體的重組效率均有所下降。為了提高重組效率，進(jìn)一步用Gap-repair的方法將P()操縱子中的TL3轉(zhuǎn)錄終止子序列敲入Red重組酶基因的下游，構(gòu)建了一個新的重組質(zhì)粒：pYM-RedT。結(jié)果表明，pYM-RedT比pYM-Red質(zhì)粒的重組效率又提高了約2倍。 為了探索Red重組酶基因表達(dá)量對體內(nèi)同源重組效率的影響，構(gòu)建了exo基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX4T1-Exo