新型重組工程系統(tǒng)的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、重組工程(Red/ET,recombinationmediatedgeneticengineering)是指由重組酶催化的DNA短片段之間的同源重組而在大腸桿菌中進(jìn)行基因克隆或改造的一種技術(shù)。重組工程可以在基因片段的任意位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確的敲入、敲除、置換,并且不受酶切位點(diǎn)的限制,現(xiàn)已逐漸成為常規(guī)的克隆手段。
　　 重組工程中的重組酶主要是來源自λ噬菌體三個(gè)基因,其中redα(exo)編碼DNA5'端至3'端的外切酶,其作用于雙鏈DN

2、A分子而產(chǎn)生3'端突出的分子;redβ(bet)編碼單鏈結(jié)合蛋白,其結(jié)合在DNA分子的3'突出端,還具有重組酶活性,促進(jìn)兩個(gè)單鏈、同源DNA分子之間的退火產(chǎn)生重組DNA;redy(gam)基因的作用是抑制大腸桿菌RecBCD對(duì)外源DNA的降解。
　　 目前主要應(yīng)用的兩種重組工程系統(tǒng)都是基于red基因構(gòu)建的。第一種系統(tǒng)是前噬菌體系統(tǒng),以美國(guó)國(guó)立癌癥研究所DonaldCourt實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大腸桿菌DY380為代表。是將缺陷九前噬菌體

3、整合至大腸桿菌基因組中構(gòu)建而成,重組酶基因由P1啟動(dòng)子所誘導(dǎo)。
　　 在DY380中,red基因由PL啟動(dòng)子嚴(yán)格調(diào)控,30℃時(shí),PL啟動(dòng)子被溫度敏感性抑制子cI857抑制,42℃時(shí)抑制解除。因此在DY380中,重組酶的表達(dá)是由30℃轉(zhuǎn)移至42℃時(shí)的溫度升高所誘導(dǎo)的。此系統(tǒng)的缺點(diǎn)是菌株需要在30℃生長(zhǎng),比在37℃下生長(zhǎng)要慢;其次,重組酶的表達(dá)需要42℃水浴進(jìn)行15分鐘精確的熱誘導(dǎo)。
　　 第二種是基于質(zhì)粒的重組酶系統(tǒng),最常

4、使用的兩個(gè)質(zhì)粒是pKD46(氨芐青霉素抗性)和pSC101-BAD-gbaA(四環(huán)素抗性)載體。在這兩個(gè)質(zhì)粒中,red基因都是由pBAD啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng),pBAD啟動(dòng)子受L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)的araC基因所激活;質(zhì)粒的復(fù)制子都是溫度敏感型復(fù)制子,在30℃才能行使復(fù)制功能,菌株需要在30℃培養(yǎng)。
　　 為了給重組工程提供更多的酶系統(tǒng),本論文中我們構(gòu)建了新的重組工程菌株和載體。通過將重組酶基因整合至大腸桿菌的基因組中構(gòu)建了一個(gè)新的重組工

5、程菌株大腸桿菌LS-GR。LS-GR在37℃生長(zhǎng),red基因受L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)。通過將含有p15A骨架的中等拷貝載體pACYC184和單拷貝的pECBAC1抗性標(biāo)記基因替換進(jìn)行驗(yàn)證其重組功能,這兩個(gè)載體都是在分子克隆研究中經(jīng)常用到的。結(jié)果表明以本菌株進(jìn)行重組工程的操作簡(jiǎn)便,重組效率高,可成為通用的重組工程用菌株。
　　 新的重組酶質(zhì)粒系統(tǒng)的構(gòu)建是通過兩種方式:第一種是在pKD46orf60a基因后面分別克隆orf63或orf