一種基因消除PCR技術的建立及應用.pdf

1、基因消除PCR(Removing PCR; R-PCR)技術是一種將聚合酶鏈式反應(PCR)技術和限制性核酸內切酶技術相結合的用以消除兩個基因群體中的非目標基因從而獲得目標基因的技術。與現(xiàn)有的篩選基因群體中目標基因的方法（抑制性差減雜交，基因芯片，高通量測序）相比，該方法具有操作較為簡單，假陽性率低，成本低廉，穩(wěn)定性好，可重復性高，適用范圍廣等優(yōu)點。玉米紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起的，在中國

2、該病已成為制約玉米產(chǎn)量的主要病害。從轉錄組水平研究紋枯病菌誘導后玉米體內基因的差異表達，是從基因水平闡釋玉米對紋枯病抗性機制的有效途徑，從而為培育廣譜、高效、穩(wěn)定、持久抗病性品種提供理論基礎。
　　 本研究提出了基因消除PCR技術的概念，初步建立起了單基因片段水平R-PCR和多基因水平R-PCR，試圖為篩選基因群體中的目標基因提供一種新的技術手段。同時，將R-PCR技術成功運用到紋枯病菌誘導玉米差異表達基因的篩選中，為建立相關抗

3、病基因表達譜和從全基因表達水平上深入探索玉米對紋枯病的系統(tǒng)抗病機制奠定基礎。本實驗以玉米自交系Y478和立枯絲核菌高致病性融合菌群AG-1-IA為研究對象，分別采集接種紋枯病菌6h，12h，24 h，36h，48 h，60 h和72 h的葉片，將該7個時間點取的葉片作為混合樣本，利用R-PCR技術篩選出該樣本相對于未受侵染的玉米葉片而言上調表達的基因，并采用熒光定量PCR技術對部分基因進行驗證，獲得主要結果如下：⑴以小麥小GTP結合蛋白

4、基因片段為起始材料，基本建立起了單基因片段水平的R-PCR，并驗證了R-PCR引物的特異性，證明了R-PCR技術在原理上是可行的。⑵以玉米Y478基因組DNA為起始材料，在單基因片段水平R-PCR的基礎上進一步優(yōu)化建立起多基因水平R-PCR，并取得較好的消除效果，進一步證明了R-PCR技術的可行性和高效性。⑶以接病的Y478 cDNA和未接病的Y478 cDNA為起始材料，采用R-PCR技術，獲得紋枯病菌誘導玉米上調表達基因片段的R-P

5、CR產(chǎn)物。將該R-PCR產(chǎn)物進行群體T-A克隆，得到的122個陽性克隆經(jīng)過測序分析，獲得53條唯一的EST序列。⑷將篩選得到的53條EST序列提交到Genbank中進行Blast比對分析，其中41條EST序列對應基因的功能是已知的，剩余12條EST序列無基因功能注釋。對篩選到的差異表達且功能已知的基因根據(jù)相關文獻進行簡單的分類，發(fā)現(xiàn)其中有8個基因與抗病、防御反應直接相關，其它33個基因在紋枯病菌與玉米互作中的作用，有待進一步的研究。⑸對