白腐真菌漆酶及同工酶基因家族的克隆表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、漆酶（p-diphenol: oxygen oxidoreductase; EC1.10.3.2）是一類含銅多酚氧化酶，其廣泛分布于高等植物及真菌中，是白腐真菌特異胞外降解酶系中的重要組分。白腐真菌漆酶與木質(zhì)素降解、酚類物質(zhì)的氧化、色素合成、孢子形成以及子實(shí)體分化等多種功能有著密切聯(lián)系。由于漆酶有著廣泛的底物作用范圍及重要的生物降解功能，其在造紙工業(yè)、生物燃料、食品加工、染料脫色、工業(yè)廢水處理等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力和開發(fā)價(jià)值。因此，開

2、展漆酶基因資源的獲取、表達(dá)調(diào)控等方面的研究對于豐富漆酶基因資源及解析漆酶基因家族及功能，促進(jìn)漆酶高效表達(dá)具有重要的理論意義及應(yīng)用價(jià)值。
　　本文以白腐真菌漆酶為核心，進(jìn)行了漆酶基因的克隆、異源表達(dá)、重組漆酶的特性以及漆酶基因家族的表達(dá)調(diào)控等一系列的研究。以白腐真菌Ganodermasp.En3,Pleurotus ostreatusBP2為出發(fā)菌株，利用簡并引物PCR、TAIL-PCR、RT-PCR、SEFA-PCR、保守引物PC

3、R技術(shù)，從菌株En3中克隆得到一條漆酶結(jié)構(gòu)基因lac-En3-1及其全長cDNA序列；從菌株BP2中得到了漆酶基因家族11條不同漆酶同工酶的cDNA序列及相應(yīng)漆酶基因上游調(diào)控序列。對相應(yīng)漆酶基因調(diào)控序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明漆酶基因上游序列中存在多個順式作用調(diào)控元件如金屬響應(yīng)元件 MRE、異生物質(zhì)響應(yīng)元件 XRE、CreA結(jié)合位點(diǎn)、NIT2結(jié)合位點(diǎn)等。將來源自Ganodermasp. En3的漆酶基因lac-En3-1進(jìn)行了畢赤酵

4、母異源表達(dá)，得到了具有漆酶活力的酵母轉(zhuǎn)化子，驗(yàn)證了其漆酶功能。對重組漆酶蛋白rLAC-En3-1進(jìn)行了分離純化并研究了其酶學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)rLAC-En3-1在pH大于7的堿性環(huán)境中具有較高的穩(wěn)定性，同時對一些酶類抑制劑如SDS、EDTA，及工業(yè)中常用的金屬離子和有機(jī)溶劑等有較好的耐受性，并在染料降解及脫毒方面顯示出良好效果。通過分別添加不同類型的誘導(dǎo)物如金屬離子，芳香化合物，金屬離子和芳香化合物的組合及醇類等，研究了白腐真菌Pleurot

5、us ostreatusBP2漆酶基因家族不同漆酶同工酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控情況，結(jié)果顯示：銅離子顯著促進(jìn)Pleurotus ostreatusBP2漆酶同工酶所有基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而鐵、錳、鉻等其它金屬離子則對部分漆酶基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)顯示出誘導(dǎo)作用。發(fā)現(xiàn)了顯著誘導(dǎo)Pleurotus ostreatusBP2基因家族轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的7種芳香化合物，不同芳香化合物的誘導(dǎo)作用存在差異。金屬離子和芳香化合物的組合誘導(dǎo)對Pleurotus ostrea

6、tusBP2部分漆酶基因有明顯協(xié)同效果。在醇類誘導(dǎo)及其它條件下Pleurotus ostreatusBP2漆酶基因轉(zhuǎn)錄水平也有所上調(diào)。通過Time Course實(shí)驗(yàn)研究了若干種芳香族化合物對于Pleurotus ostreatus BP2漆酶同工酶基因轉(zhuǎn)錄的影響，發(fā)現(xiàn)肉桂酸、3,4,5-三甲氧基肉桂酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、香草酸在第8天對Pleurotus ostreatusBP2漆酶基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)效果明顯，4-甲氧

7、基肉桂酸、3-羥基-4甲氧基肉桂酸在第10天對Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因轉(zhuǎn)錄水平的誘導(dǎo)效果明顯。綜上所述，從Ganoderma sp.En3中克隆得到一條漆酶基因lac-En3-1，從Pleurotus ostreatusBP2中克隆得到了11條不同漆酶同工酶基因cDNA及其上游調(diào)控區(qū)域。將 lac-En3-1漆酶編碼基因進(jìn)行了畢赤酵母異源表達(dá)，純化得到的重組漆酶rLAC-En3-1具有較好的有機(jī)溶劑、金屬離