丹參漆酶基因的克隆表達和功能研究.pdf

1、丹參（Salvia Miltiorrhiza Bunge）為唇形科鼠尾草屬植物，其根及根莖入藥，主要用于治療心血管疾病。課題組前期通過同位素示蹤發(fā)現(xiàn)迷迭香酸(RA)是合成丹參酚酸B(LAB)的重要前體[2]，并推測丹參漆酶是催化RA在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)化形成LAB的關(guān)鍵酶。本課題目的在于驗證這個推測，并初步探索丹參漆酶基因家族在酚酸類代謝途徑中的功能與作用。我們從丹參基因組數(shù)據(jù)庫中獲得了丹參漆酶并借助各種手段進行篩選獲得了目標漆酶基因，在體外和

2、體內(nèi)探索了其在丹參酚酸代謝途徑中的作用。
　　本文主要從以下幾個方面對丹參漆酶的體內(nèi)、體外功能進行研究:
　　1.以RA為底物，使用商品化的漆樹漆酶進行催化反應，在產(chǎn)物中檢測到了少量的LAB。該結(jié)果初步驗證了植物漆酶在體外具有催化RA生成LAB的能力。
　　2.借助生物信息學分析方法，我們對丹參基因組數(shù)據(jù)進行了充分的挖掘。將NCBI上的已有漆酶基因序列與丹參基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選得到29條完整的丹參漆酶（Smlac

3、s）序列，并對它們進行了理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、氨基酸同源性等特征分析。初步篩選得到15條可能具有該催化功能的Smlacs。
　　3.我們考察了29條Smlacs在植物中的組織特異性和受甲基茉莉酸甲酯(MeJA)誘導情況。結(jié)果顯示15條Smlacs中同時滿足MeJA誘導能夠調(diào)控其表達量升高和丹參根中表達量相對其他部位較高兩個條件的丹參漆酶有三條，它們分別是Smlac7、Smlac20和Smlac28。因此，本課題將這三條基因作為候選基

4、因進行體外功能和體內(nèi)功能的研究。
　　4.通過合適的引物進行PCR反應，獲得了3條目的漆酶基因;在畢赤酵母表達體系中進行了蛋白表達;已經(jīng)完成了畢赤酵母表達載體的構(gòu)建，并成功轉(zhuǎn)入了GS115宿主細胞中，使用抗性篩選獲得了His+菌株。目前蛋白還在進一步誘導表達當中。
　　5.利用RNAi技術(shù)獲得了三個Smlacs的轉(zhuǎn)基因發(fā)根。使用RT-PCR和qPCR技術(shù)對發(fā)根進行了鑒定，結(jié)果表明陽性發(fā)根中的目的基因的表達量與空載對照組發(fā)根中

5、該基因表達量相比明顯降低，說明目的基因的表達成功的被抑制了。轉(zhuǎn)基因發(fā)根與空白對照組之間在形態(tài)也出現(xiàn)了差異。利用LC-MS/MS技術(shù)對轉(zhuǎn)基因發(fā)根進行RA和LAB的含量測定。結(jié)果顯示三種轉(zhuǎn)基因發(fā)根中LAB的含量均有不同程度的下降，三種轉(zhuǎn)基因發(fā)根RA的含量較空白對照組均有略微的上升。該結(jié)果表明三個漆酶均能夠影響LAB在體內(nèi)的合成;
　　6.通過在轉(zhuǎn)基因丹參發(fā)根中過量表達Smlac7和Smlac20，對其調(diào)控作用進行進一步確證。RT-PC

6、R和qPCR技術(shù)表明陽性發(fā)根中的目的基因的表達量均有不同程度的提高。同時，檢測發(fā)根中LAB和RA的含量，結(jié)果表明LAB的含量明顯高于空白對照組，而RA的含量并未出現(xiàn)明顯的下降。該結(jié)果表明過表達兩個漆酶基因?qū)Πl(fā)根中丹參酚酸B的含量均有明顯的提高，可以作為代謝調(diào)控丹參迷迭香酸和丹參酚酸B合成的一種新方法。
　　綜上所述，本研究在體外驗證了漆酶具有催化RA生成LAB功能的前提下，通過生物信息學的方法對丹參漆酶進行篩選，并對具有潛在功能的