丹參漆酶基因的克隆表達(dá)和功能研究.pdf

1、丹參（Salvia Miltiorrhiza Bunge）為唇形科鼠尾草屬植物，其根及根莖入藥，主要用于治療心血管疾病。課題組前期通過同位素示蹤發(fā)現(xiàn)迷迭香酸(RA)是合成丹參酚酸B(LAB)的重要前體[2]，并推測(cè)丹參漆酶是催化RA在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)化形成LAB的關(guān)鍵酶。本課題目的在于驗(yàn)證這個(gè)推測(cè)，并初步探索丹參漆酶基因家族在酚酸類代謝途徑中的功能與作用。我們從丹參基因組數(shù)據(jù)庫中獲得了丹參漆酶并借助各種手段進(jìn)行篩選獲得了目標(biāo)漆酶基因，在體外和

2、體內(nèi)探索了其在丹參酚酸代謝途徑中的作用。
　　本文主要從以下幾個(gè)方面對(duì)丹參漆酶的體內(nèi)、體外功能進(jìn)行研究:
　　1.以RA為底物，使用商品化的漆樹漆酶進(jìn)行催化反應(yīng)，在產(chǎn)物中檢測(cè)到了少量的LAB。該結(jié)果初步驗(yàn)證了植物漆酶在體外具有催化RA生成LAB的能力。
　　2.借助生物信息學(xué)分析方法，我們對(duì)丹參基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了充分的挖掘。將NCBI上的已有漆酶基因序列與丹參基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，篩選得到29條完整的丹參漆酶（Smlac

3、s）序列，并對(duì)它們進(jìn)行了理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、氨基酸同源性等特征分析。初步篩選得到15條可能具有該催化功能的Smlacs。
　　3.我們考察了29條Smlacs在植物中的組織特異性和受甲基茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)情況。結(jié)果顯示15條Smlacs中同時(shí)滿足MeJA誘導(dǎo)能夠調(diào)控其表達(dá)量升高和丹參根中表達(dá)量相對(duì)其他部位較高兩個(gè)條件的丹參漆酶有三條，它們分別是Smlac7、Smlac20和Smlac28。因此，本課題將這三條基因作為候選基

4、因進(jìn)行體外功能和體內(nèi)功能的研究。
　　4.通過合適的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得了3條目的漆酶基因;在畢赤酵母表達(dá)體系中進(jìn)行了蛋白表達(dá);已經(jīng)完成了畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建，并成功轉(zhuǎn)入了GS115宿主細(xì)胞中，使用抗性篩選獲得了His+菌株。目前蛋白還在進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)當(dāng)中。
　　5.利用RNAi技術(shù)獲得了三個(gè)Smlacs的轉(zhuǎn)基因發(fā)根。使用RT-PCR和qPCR技術(shù)對(duì)發(fā)根進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明陽性發(fā)根中的目的基因的表達(dá)量與空載對(duì)照組發(fā)根中

5、該基因表達(dá)量相比明顯降低，說明目的基因的表達(dá)成功的被抑制了。轉(zhuǎn)基因發(fā)根與空白對(duì)照組之間在形態(tài)也出現(xiàn)了差異。利用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因發(fā)根進(jìn)行RA和LAB的含量測(cè)定。結(jié)果顯示三種轉(zhuǎn)基因發(fā)根中LAB的含量均有不同程度的下降，三種轉(zhuǎn)基因發(fā)根RA的含量較空白對(duì)照組均有略微的上升。該結(jié)果表明三個(gè)漆酶均能夠影響LAB在體內(nèi)的合成;
　　6.通過在轉(zhuǎn)基因丹參發(fā)根中過量表達(dá)Smlac7和Smlac20，對(duì)其調(diào)控作用進(jìn)行進(jìn)一步確證。RT-PC

6、R和qPCR技術(shù)表明陽性發(fā)根中的目的基因的表達(dá)量均有不同程度的提高。同時(shí)，檢測(cè)發(fā)根中LAB和RA的含量，結(jié)果表明LAB的含量明顯高于空白對(duì)照組，而RA的含量并未出現(xiàn)明顯的下降。該結(jié)果表明過表達(dá)兩個(gè)漆酶基因?qū)Πl(fā)根中丹參酚酸B的含量均有明顯的提高，可以作為代謝調(diào)控丹參迷迭香酸和丹參酚酸B合成的一種新方法。
　　綜上所述，本研究在體外驗(yàn)證了漆酶具有催化RA生成LAB功能的前提下，通過生物信息學(xué)的方法對(duì)丹參漆酶進(jìn)行篩選，并對(duì)具有潛在功能的