白腐真菌漆酶基因表達調控及其功能研究.pdf

1、白腐真菌依賴于一系列的木質素降解酶系，能夠高效地對各種天然木質纖維素及人工合成化學物質進行非專一性的降解。其中一種含銅的多酚氧化酶：漆酶（Laccase）是白腐真菌降解木質素的重要酶類，具有廣泛的底物作用范圍及重要的生物降解功能，在木質素降解與生物質能源底物的獲取、難降解環(huán)境污染物等異生物質的降解、染料脫色、造紙工業(yè)中的紙漿去木質化、食品加工等領域都具有巨大的應用價值和潛能。因此，漆酶基因資源的獲取、生理功能及其表達調控的研究對于豐富白

2、腐真菌分子生物學理論及完善相關生物技術手段極其重要?；诖?，本論文緊密圍繞白腐真菌重要的木質素降解酶漆酶開展了一系列的分子生物學研究，主要研究結果如下：
　　利用簡并引物PCR和TAIL-PCR等基因組步行技術以及RT-PCR技術，從一株漆酶活性高、能夠降解不同結構染料的白腐真菌菌株Trametes sp.48424中克隆獲得一個漆酶基因lac48424-1及其全長cDNA序列。利用SEFA-PCR等基因組步移技術克隆得到lac4

3、8424-1漆酶基因啟動子上游調控序列，預測有多個可能參與轉錄調控的順式作用DNA調控元件。成功實現(xiàn)了lac48424-1漆酶基因在畢赤酵母中的異源表達，驗證了lac48424-1漆酶基因能夠編碼有活性的漆酶蛋白。
　　從成功表達lac48424-1漆酶基因的畢赤酵母轉化子中純化得到酵母重組漆酶蛋白rLAC48424-1，對其酶學性質以及降解不同結構染料和模擬染料廢水的功能進行了研究。結果表明重組漆酶rLac48424-1具有優(yōu)良

4、的酶學性質。相比于某些已報道的其它漆酶，rLac48424-1具有更好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，重組漆酶rLac48424-1在50℃放置1小時后，相對酶活仍有88.0％，rLac48424-1在pH=5條件下保存7天，相對酶活仍有87.6％。重組漆酶rLac48424-1對多種有機溶劑如乙腈、丙酮、甲醇、乙醇等具有較強的耐受性。rLac48424-1對不同結構的染料和模擬染料廢水具有更強的脫色降解能力。小分子介體丁香醛可以有效提高rLa

5、c48424-1對某些難降解染料的降解能力。
　　深入研究了在畢赤酵母中異源表達的漆酶基因參與畢赤酵母抵抗氧化脅迫的生物學功能及其機制，發(fā)現(xiàn)來源于白腐真菌的漆酶基因在畢赤酵母中的表達可以顯著增強酵母細胞抵抗過氧化氫介導的氧化脅迫的能力。進一步研究表明：外源過氧化氫誘發(fā)的氧化脅迫能夠誘導增強白腐真菌漆酶基因在畢赤酵母中的表達，而漆酶基因的表達能夠誘導激活酵母谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)相關基因的轉錄，從而通過有效提升酵母細胞谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)

6、的水平（包括胞內谷胱甘肽含量、谷胱甘肽過氧化物酶活性、谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和谷胱甘肽還原酶活性等）來增強酵母細胞抵抗氧化脅迫的能力。
　　根據(jù)漆酶基因lac48424-1啟動子調控區(qū)域存在的不同順式作用元件（如：金屬離子響應元件MRE、異生物質響應元件XRE等）的預測結果，設計了一系列的誘導物，研究了這些不同誘導物和環(huán)境因素對Trametes sp.48424漆酶基因lac48424-1轉錄的調控作用。結果表明不同金屬離子、多

7、種芳香化合物、不同木素等對漆酶基因lac48424-1的轉錄具有較強的誘導增強作用，不同因素對漆酶基因轉錄的誘導調控可能與不同順式作用調控元件有關。
　　綜上所述，本論文不僅成功實現(xiàn)了白腐真菌漆酶基因的異源表達及活性蛋白功能驗證，而且發(fā)現(xiàn)了漆酶基因的表達能夠通過有效提升酵母細胞谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)水平來增強抗氧化脅迫的能力。對白腐真菌漆酶基因上游調控元件的預測及多種因子可調控lac48424-1漆酶基因轉錄的研究結果，為進一步深入研