大鼠急性缺血性腎損傷對肺的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、在現代醫(yī)學中,急性腎損傷(acute kidney injury,AKK)是十分常見、復雜的臨床問題之一。危重病人中有30%的病人發(fā)生急性腎損傷。有研究顯示重癥監(jiān)護室(ICU)病人有5-6%的病人發(fā)生急性腎損并且需要腎替代治療。雖然透析技術及高級治療方法不斷改進,但急性腎損傷的死亡率仍居高不下,達到了40-60%。在本質上,腎功能衰竭本身通常并不是AKI的死因,而是心源性和非心源性急性肺損傷(ALI)導致了AKI的高死亡率。有研究顯示,

2、ICU中AKI常常合并ALI,尤其是急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS),這類患者的死亡率接近80%。
   腫瘤壞死因子α(TNF-α)是炎癥反應過程中最早出現且最重要的炎癥介質之一。TNF-α、白細胞介素6(IL-6)等多種細胞因子協同構成炎性細胞網絡,參與創(chuàng)傷和多種炎癥性疾病的病理過程。幾個不同的動物模型所致的ALI/ARDS中,TNF-α、IL-6的含量均表現為升高。有研究證實在急性腎損傷的早期患者體內炎癥介質發(fā)生了改變,這可

3、能是急性腎損傷引起遠隔器官損傷的機制。另外,近年研究證實水通道蛋白1(AQP1)及α肺上皮鈉通道蛋白(α-ENac)在維持肺泡腔內的液體平衡具有重要作用,在急性肺損傷時水通道蛋白1(AQP1)及鈉通道蛋白表達的下降促進了肺損傷的發(fā)生。
   肺血管內皮細胞襯于血管壁內表面,是血管壁與血液間的分界細胞,其形態(tài)結構受損或功能改變導致血管內皮屏障功能的損害,促進急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展。有研究發(fā)現,內皮細胞骨架與血管內皮通透性的調節(jié)密切

4、相關,對于維持內皮細胞的屏障功能有重要意義。纖維狀肌動蛋白(F-actin)是細胞骨架中的主要收縮蛋白,增加其含量可以使內皮細胞的通透性增加,導致血管屏障功能的損害。熱休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)作為一種重要的肌動蛋白結合蛋白,在細胞內可被p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號途徑磷酸化,進而參與調節(jié)肌動蛋白聚合/解聚過程,使肌動蛋白細胞骨架發(fā)生重組,促進急性肺損傷的發(fā)生。
  

5、我們擬通過雙腎動靜脈央閉建立急性缺血性腎損傷大鼠模型,觀察大鼠肺病理及病理生理的變化。與內毒素所致的肺損傷相比,二者是否存在區(qū)別。明確上皮細胞鈉通道和水通道蛋白1在急性腎損傷所致肺損傷的作用。觀察p38MAPK-HSP27信號通路在急性腎損傷誘發(fā)急性肺損傷的過程中的變化規(guī)律。并與內毒素所致肺損傷相比較,該信號通路在肺損傷的發(fā)病過程中機制上是否相同。為急性腎損傷繼發(fā)急性肺損傷的的預防、早期診治提供實驗及理論依據。
   方法:

6、r>   1、動物模型制備和分組
   健康雄性Wistar大鼠(300-320g),予5%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉,氣管切開,頸動、靜脈穿刺,留置導管。監(jiān)測呼吸頻率、心率、收縮壓、舒張壓、平均動脈壓及中心靜脈壓。大鼠狀態(tài)穩(wěn)定半小時后,隨機分成5組。A組:正常對照組,腹正中切口,分離雙側腎動靜脈,不予結扎雙腎動靜脈;給予腹腔注射生理鹽水4ml。B組:急性腎損傷組,腹正中切口,分離雙側腎動靜脈,給予雙腎動靜脈夾閉;給予

7、腹腔注射生理鹽水4ml。C組:內毒素組,腹正中切口,分離雙側腎動靜脈,不予結扎雙腎動靜脈;給予腹腔注射內毒素(5mg/kg)2ml、腹腔注射生理鹽水2ml。D組:急性腎損傷組+SB203580,腹正中切口,分離雙側腎動靜脈,給予雙腎動靜脈夾閉;給予腹腔注射生理鹽水2ml、SB203580(p38MAPK的專一抑制劑為吡啶咪唑類衍生物)(2mg/kg)2ml。E組:內毒素組+SB203580,腹正中切口,分離雙側腎動靜脈,不予結扎雙腎動靜

8、脈;給予腹腔注射生理鹽水2ml、內毒素(5mg/kg)2ml。
   2、標本收集與檢測
   造模后,各組大鼠分別于實驗開始后的0、2、4、6、8小時被處死,每個時間點處死6只大鼠。所有大鼠處死前采集動脈血行血氣分析,處死后留取靜脈血標本測定血肌酐、IL-6與TNF-α。開胸暴露兩肺,先觀察肺臟大體改變,結扎右肺門,取右上肺,用4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,蘇木素伊紅(HE)染色檢查肺組織病理變化及免疫熒光(I

9、F)方法檢測內皮細胞內肌動蛋白F、G(actin-F、G);右肺中葉,迅速液氮凍存待測AQP1、α-ENac、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)及磷酸化熱休克蛋白27(p-HSP27);取右下肺,用濾紙吸去右肺下葉血,稱濕重后,置烤箱中(80℃,72 h)烤至恒重,稱干重,計算肺W/D比值。左側肺行支氣管肺泡灌洗,收集到的支氣管肺泡灌洗液(BALF)凍存待測IL-6、TNF-α與BALF中蛋白含量。
   3、

10、統計學處理
   采用SPSS16.0軟件進行統計學分析,計量數據均以(x)±s表示。組間比較采用t檢驗。兩組值的相關性檢驗用Pearson相關分析。P<0.05表示差異有統計學意義。
   結果:
   1、A組大鼠在實驗后血肌酐濃度沒有明顯變化。B組在實驗后6小時、8小時肌酐水平明顯增加,與A組相比有顯著性差異。C組實驗后血肌酐濃度也沒有明顯變化,與A組比較無明顯變化。
   2、B組大鼠在實驗后6小

11、時動脈血pH值開始下降,酸中毒逐漸加重,與其它組相比有顯著性差異。各組動脈血二氧化碳呈下降趨勢,但各組間沒有差別,沒有統計學意義。B組與A組的氧分壓各時間點間相比無差別,C組氧分壓從6小時開始逐漸下降,與其它兩組比較有差異,有統計學意義。
   3、與A組相比,C組和B組在實驗后2小時肺泡灌洗液中蛋白水平、肺W/D開始明顯增加,C組與B組相比有顯著性差異。在給予了p38MAPK抑制劑SB203580后的D組及E組肺泡灌洗液中蛋白

12、水平及肺W/D分別比B及C組明顯減少。相對于D組來說,E組肺泡灌洗液中蛋白水平較高,有統計學意義。
   4、B組與C組實驗后8小時肺泡上皮腫脹,肺泡壁增寬,肺泡間質和肺泡腔水腫明顯,肺泡內炎癥細胞、紅細胞和蛋白滲出明顯增多,表現出急性肺損傷的典型病理改變,但B組的肺損傷程度較輕。在給予了p38MAPK抑制劑SB203580后的D及E組內可見肺泡內炎癥細胞、紅細胞和蛋白滲出、間質與肺泡水腫均較B組及C組減輕。
   5、

13、B組與C組均在實驗后2小時血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6的濃度開始增加,與A組相比有顯著差異。同時與B組相比,C組大鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6的濃度明顯增加。
   6、B組大鼠在實驗后2小時肺組織中AQP1、α-ENac表達開始逐漸減少,與A組相比有明顯的差異性;C組大鼠肺組織中AQP1、α-ENac的表達減少更加明顯,與A組和B相比均有顯著差異。大鼠的肺AQP1、α-ENac與肺泡灌洗液中TNF-α、I

14、L-6成負相關,C組的AQP1、α-ENac與TNF-α、IL-6的相關性好于B組。
   7、運用Western blot方法檢測肺組織中p-p38MAPK及p-HSP27濃度,B組與C組均在實驗后2小時p-p38MAPK及p-HSP27的肺內表達開始增加,與A組相比有顯著性差異。C組大鼠p-p38MAPK及p-HSP27的表達比B組明顯增加。在給予了p38MAPK抑制劑SB203580后的D組及E組肺p-HSP27的表達分別

15、比B及C組明顯減少。
   8、B、C兩組實驗后8小時的F-actin的表達明顯比A組實驗后0小時及8小時的表達增加,給予p38MAPK抑制劑SB203580的D組、E組F-actin的表達分別比B組、C兩組減少。
   9、B組肺泡灌洗液中細胞因子TNF-α、IL-6與p-p38MAPK成正相關,相關系數分別為0.565、0.434。C組肺泡灌洗液中細胞因子TNF-α、IL-6的與p-p38MAPK成正相關,r=0.6

16、33、0.494。C組的相關性好于B組。
   結論:
   1、這表明通過對大鼠雙側腎動靜脈的夾閉,可以成功的建立急性腎損傷模型。
   2、急性腎損傷早期肺泡上皮-內皮屏障功能已經受到了影響,肺泡內皮細胞通透性增加,肺上皮細液體清除下降,急性肺損傷已經發(fā)生,但與內毒素引起的急性肺損傷相比程度較輕。
   3、急腎損傷后可能由于體內各種有毒代謝產物的蓄積及手術創(chuàng)傷等激活了全身炎癥反應,并且炎癥介質通過腎

17、臟的排瀉、滅活而減少,從而使大鼠血液循環(huán)中TNF-α、IL-6含量明顯增加。但與急性腎損傷組相比,內毒素引起的TNF-α、IL-6增高更加明顯。
   4、急性腎損傷的早期肺表達AQP1及α-ENac的減少,可能是急性腎損傷早期引起肺損傷的原因之一;并且AQP1及α-ENac表達下降,細胞因子起了重要的作用。急性腎損傷后不僅細胞因子參與了AQP1及α-ENac的調節(jié),血漿滲透壓的改變、酸中毒等可能也參與了AQP1及α-ENac的

18、調節(jié)。
   5、通過雙腎動靜夾閉誘導的急性腎損傷可以通過激活p38MAPK-HSP27信號通路,引起急性肺損傷的發(fā)生。如阻斷p38MAPK-HSP27信號通路可以減輕肺損傷的發(fā)生。
   6、在通過腹腔注射內毒素引起的急性肺損傷的過程中,p38MAPK-HSP27信號通路也發(fā)揮了重要的作用。但急性腎損傷激活p38MAPK-HSP27信號通路的始動因素除了TNF-α、IL-6外,急性腎損傷引起的體內內環(huán)境的改變,如酸中毒

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