經腎動脈移植脂肪干細胞對大鼠急性缺血性腎損傷的治療作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行了論述:
　　第一部分 SD大鼠脂肪干細胞分離培養(yǎng)鑒定及大鼠急性缺血性腎損傷模型的建立。
　　目的:脂肪干細胞(adipose derived stem cells，ASCs)分離培養(yǎng)和鑒定;建立大鼠急性缺血性腎損傷（ischemic acute kidney injury）模型。
　　方法:采用Ⅰ型膠原酶消化法獲取SD大鼠腹股溝處皮下脂肪組織中的ASCs，貼壁法純化，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)

2、及生長過程，取第3代細胞用于實驗。體外標準誘導下檢測此類細胞成脂、成骨等多向分化能力，并以FCM儀檢測其表面標志物CD29、CD90、CD34和CD45。以無創(chuàng)動脈夾持續(xù)夾閉雙側腎蒂45min的方法建立大鼠iAKI模型，并檢測正常大鼠和iAKI大鼠再灌注24hr時的血肌酐(Scr)。結果:1.原代細胞呈短梭形或小多角形，貼壁集落生長，貼壁細胞經3次傳代后，細胞大小及形態(tài)趨于一致，呈長梭形旋渦狀、放射狀生長。2.FCM鑒定ASCs細胞表面

3、抗原。
　　結果：CD29和CD90高表達，CD34和CD45低表達，符合ASCs公認的免疫表型;在標準成脂誘導條件下，油紅O染色可見脂肪滴證實其可向脂肪細胞分化;在標準成骨誘導條件下，VonKossa染色可見礦化結節(jié)證實其可向成骨細胞分化。3.ASCs傳至第9代仍可保持平均每天1.33×104個的增值速度。4.正常大鼠血肌酐為41.67±5.92μmol/L，iAKI大鼠再灌注24hr時的血肌酐為261.99±5.091mol/

4、L。
　　結論:1.通過Ⅰ型膠原酶消化法可獲得較高純度的大鼠ASCs，細胞貼壁生長并且高表達CD29和CD90，低表達CD34和CD45，符合公認的ASCs免疫表型。2.分離獲得的ASCs在標準誘導條件下可誘導分化為成骨細胞、成脂細胞，多向分化潛能證實其為干細胞。3.大鼠腹股溝處皮下脂肪組織中提取的ASCs自我更新能力旺盛，傳至第9代仍可保持較快增殖速度。4.iAKI大鼠24hr時血肌酐較正常大鼠顯著升高(P＜0.05)，iAKI

5、模型建立成功。
　　第二部分 經左側腎動脈移植ASCs對大鼠急性缺血性腎損傷的治療作用研究。
　　目的:探討經左側腎動脈移植ASCs對大鼠急性缺血性腎損傷（iAKI）的治療作用。
　　方法:持續(xù)夾閉SD大鼠雙側腎蒂45min建立iAKI模型。將建模成功后的SD大鼠隨機分成兩組:對照組（再灌注后即刻經左腎動脈注射500μiPBS，n=30）、ASCs治療組（再灌注后即刻經腎動脈移植5×105 ASCs，n=30）。術后1

6、2、24、48、72hr和1wk時處死大鼠，取血、分離血清，分別測定血清肌酐值，光學顯微鏡觀察腎臟病理損傷及細胞凋亡、炎癥反應及細胞增生情況，并進行腎小管間質損傷評分和統(tǒng)計學分析。
　　結果:1.ASCs治療組Scr水平在各時間點均顯著低于對照組(P＜0.05)。2.腎臟病理及腎小管間質損傷評分提示:與對照組相比，治療組再灌注12、24和48hr時損傷顯著減輕。3.與對照組相比，治療組左側腎臟TUNEL染色和巨噬細胞浸潤染色積分再

7、灌注12、24、48、72hr和1wk時顯著降低(P＜0.05);核增殖抗原48hr時顯著增加(P＜0.05)，72hr和1wk時減少(P＜0.05)。與治療組右側腎臟相比，治療組左側腎臟于再灌注后24hr腎小管間質損傷評分顯著降低(2.40±0.50，P＜0.05)，再灌注后1wk時，腎組織TUNEL染色陽性細胞數減少(P＜0.05)，再灌注12、48、72hr和1wk時巨噬細胞浸潤染色積分減少(P＜0.05)，再灌注后48hr時核增

8、殖抗原表達增加(P＜0.05)，再灌注后72hr和1wk時核增殖抗原表達減少(P＜0.05)。
　　結論:ASCs經腎動脈移植可顯著改善iAKI大鼠腎功能、減輕腎臟病理損傷和細胞凋亡、減少炎癥細胞浸潤、促進損傷后修復。此外，直接移植ASCs的左腎在細胞凋亡、炎癥細胞浸潤、損傷修復方面均優(yōu)于右腎，提示ASCs進入受損部位或受損附近部位后發(fā)揮了重要作用。
　　第三部分 經左側腎動脈移植后的ASCs在AKI大鼠體內分布情況。

9、>　　目的:研究標記后的ASCs經大鼠左側腎動脈移植后在AKI大鼠體內分布情況。
　　方法:選擇CM-Dil標記ASCs，熒光倒置顯微鏡觀察細胞染色情況。參照第二部分方法制作大鼠iAKI模型，再灌注后即刻經左腎動脈移植5×105 CM-Dil標記的ASCs，術后12、24、48、72hr和1wk時處死大鼠，制作冰凍切片，DAPI標記細胞核，熒光倒置顯微鏡觀察腎、肺、肝、脾、心臟內的CM-Dil陽性細胞的分布情況，并計數不同時間點雙

10、側腎臟單個腎小球內平均ASCs數量。
　　結果:1.ASCs腎內分布情況:CM-Dil陽性細胞主要分布于左側腎小球內，其中移植后12hr和24hrASCs較多，48hr、72hr和1wk時ASCs數量逐漸減少;右腎所有時間點均未觀察到CM-Dil陽性細胞。2.ASCs在肺、肝、脾、心臟的分布情況:48hr、72hr時肺內存在少量CM-Dil陽性細胞，12hr、24hr、1wk時未觀察到CM-Dil陽性細胞;48hr肝內存在少量CM

11、-Dil陽性細胞，其他時間點未觀察到CM-Dil陽性細胞;脾臟和心臟在各時間點均未觀察到CM-Dil陽性細胞。2.12hr、24hr、48hr、72hr、1wk時單個腎小球內CM-Dil陽性細胞計數分別為:6.33±1.75、5.67±1.15、4.5±1.05、3.43±1.06、2.5±1.29個。
　　結論:1.選擇CM-Dil標記ASCs，進行體內示蹤并觀察其分布情況是可行的。2.經左側腎動脈移植的ASCs全部分布在左側腎