支氣管哮喘相關基因的多態(tài)性研究.pdf

1、支氣管哮喘是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，在臨床上常表現為反復發(fā)作的喘息、咳嗽、呼吸困難等，受遺傳因素和環(huán)境因素間復雜的相互作用而發(fā)病。近幾十年來，隨著工業(yè)化的進展和環(huán)境的改變，哮喘發(fā)病率和死亡率在大多數國家呈上升的趨勢。家系和雙子研究顯示出哮喘發(fā)病有很強的個體遺傳特質。使用定位克隆技術和候選基因的方法，發(fā)現人類多個染色體的不同區(qū)域及多個候選基因與哮喘發(fā)病相關，其中就有位于人類染色體5q31-33區(qū)的TIM-4基因、IL-4基因、IL-1

2、3基因、CD14基因，位于染色體16p11-12區(qū)的IL-4Rα基因，以及位于12q13-24區(qū)的STAT6基因。研究表明，Th1/Th2細胞及其分泌的細胞因子失衡在哮喘的發(fā)病機制中起著主要的作用，而哮喘通常被認為是一種Th2型疾病。TIM-4基因是新近發(fā)現的TIM基因家族中一員，與TIM-1結合后可提供一個協(xié)同刺激信號介導Th2細胞的增殖與分化。IL-4、IL-13已被認為是傳統(tǒng)的哮喘易感基因，國內外多篇文獻報道了關于其基因多態(tài)性與哮

3、喘的關聯(lián)性研究，但結果卻未能得到統(tǒng)一。IL-4Rα基因是IL-4、IL-13基因受體的共同組成部分，STAT6基因是IL-4/IL-13通路執(zhí)行生物學功能的轉錄激活因子，兩者同樣在哮喘的發(fā)病中起著重要的作用。CD14基因位于哮喘易感區(qū)5q31.1，有報道稱位于啟動子區(qū)的-C159T突變與兒童哮喘及成人血清高IgE水平相關。因為哮喘是一種復雜的多基因性疾病，因此研究多個基因之間的交互作用對哮喘發(fā)病的影響是十分必要的。雖然上述6個基因的多態(tài)

4、性位點在一些人群中報道與哮喘具有相關性，但其基因間的交互作用與哮喘的關聯(lián)卻研究甚少，因此我們研究其基因的交互作用對哮喘的影響可能會對哮喘的發(fā)病機理帶來新的認識。一般來說，在疾病的關聯(lián)研究中，如果僅僅只使用常規(guī)的病例對照研究可能由于人群分層的影響而帶來假陽性/假陰性結果，因此，我們采取病例對照和家系對照相結合的方法，避免這些不利的影響，從而能更加嚴格地說明其基因多態(tài)性與哮喘的相關關系。
　　 本課題我們首先探討了以CRS-RFLP

5、法研究TIM-4基多態(tài)性與支氣管哮喘的相關關系，同時也是基于CRS-RFLP方法學的建立。然后基于CRS-RFLP的基礎上，使用病例對照研究了IL-4、IL-13、IL-4Rα、STAT6、CD14基因共8個SNPs的單個SNP及單倍型與支氣管哮喘的關系，同時，運用MDR方法來分析其基因交互作用與哮喘的相關關系。最后我們使用核心家系資料，利用單個SNP、單倍型的關聯(lián)研究，以及基于家系的基因交互作用來探討上述5個哮喘候選基因的8個SNPs

6、與中國中部地區(qū)漢族人群支氣管哮喘及血清總IgE的相關關系。本研究共分為如下的三個部分：
　　 第一部分 運用CRS-RFLP法研究TIM-4基多態(tài)性與支氣管哮喘的相關關系
　　 目的
　　 探討T細胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白-4（T cells immunoglobulin domain and mucin domain protein-4，TIM-4）基因外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)、外顯子3區(qū)Val1

7、72Met(G/A)、外顯子9區(qū)Val365Met(G/A)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與中國中部地區(qū)漢族人群支氣管哮喘及其表型的相關關系。
　　 方法
　　 采用創(chuàng)造酶切位點－限制性片段長度多態(tài)性（CRS-RFLP）的方法對中國中部地區(qū)185例哮喘患者和162例健康者TIM-4基因外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)、外顯子3區(qū)Val172Met(G/A)、外顯子9區(qū)Val365Met(G/A)的多態(tài)性進行分析，計算基因

8、型和等位基因頻率，并比較其在兩組中的差異。采用化學發(fā)光法測定血清總IgE含量，比較其在哮喘患者各位點不同基因型之間的差異。
　　 結果
　　 （1）TIM-4基因外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)位點GG、GA基因型頻率，G、A等位基因頻率在哮喘組和對照組均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），本位點在中國中部地區(qū)漢族人群共347個標本中未檢測到AA基因型。（2）本試驗在中國中部地區(qū)漢族人群共347個標本中未檢測到TIM-4外

9、顯子3區(qū)Val172Met(G/A)的多態(tài)性，所有標本均為GG型。（3）本試驗在中國中部地區(qū)漢族人群共347個標本中未檢測到TIM-4外顯子9區(qū)Val365Met(G/A)的多態(tài)性，所有標本均為GG型。（4）哮喘組血清總IgE含量在外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)位點不同基因型間差異無統(tǒng)計學意義。
　　 結論
　　 TIM-4基因外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)存在單核苷酸多態(tài)性變異，但該位點的變異與中國中部地區(qū)

10、漢族人群支氣管哮喘易感性及其表型血清總IgE水平無關；TIM-4基因外顯子3區(qū)Val172Met(G/A)、外顯子9區(qū)Val365Met(G/A)在中國中部地區(qū)漢族人群中未發(fā)現單核苷酸多態(tài)性。
　　 第二部分 IL-4、IL-13、IL-4Rα、STAT6、CD14基因多態(tài)性的單個SNP及其基因交互作用與支氣管哮喘的相關性研究
　　 目的
　　 探討IL-4-C33T、IL-4-C589T、IL-13 R130Q

11、、IL-13 C1923T、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、CD14-C159T、STAT6 C2892T多態(tài)性位點：1）.單個SNP；2）.IL-4、IL-13、IL-4Rα基因單倍型；3）.上述8個多態(tài)性位點的基因交互作用與中國中部地區(qū)漢族兒童哮喘的相關性。
　　 方法
　　 采用創(chuàng)造酶切位點－限制性片段長度多態(tài)性（CRS-RFLP）的方法對中國中部地區(qū)252例哮喘兒童和227例健康兒童共479名兒童I

12、L-4-C33T、IL-4-C589T、IL-13 R130Q、IL-13 C1923T、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、CD14-C159T、STAT6 C2892T的多態(tài)性進行分析。使用基因計數法計算單個SNP與哮喘的相關關系；使用SHEsis在線軟件對IL-4、IL-13、IL-4Rα基因分別進行單倍型分析；使用多因子降維法（MDR）檢測8個SNPs之間的基因交互作用與哮喘的相關關系。
　　 結果
　　

13、 8個SNPs中僅IL-13 R130Q和IL-13 C1923T位點的基因型頻率和等位基因頻率在哮喘兒童與健康兒童間差異有統(tǒng)計學意義。IL-13 R130Q位點的A等位基因和IL-13 C1923T位點的T等位基因具有較高的哮喘發(fā)病風險（OR=1.59，95％ CI 1.20-2.09；OR=1.57，95％ CI 1.19-2.08）。其余6個多態(tài)性位點的單個SNP與哮喘無相關性。通過單倍型分析，由C1923T和R130Q構成的I

14、L-13基因單倍型中，CG和TA單倍型與兒童哮喘顯著相關（P＜0.05）。由I75V和Q576R構成的IL-4Rα基因單倍型中，GA和AA單倍型與兒童哮喘具有相關性（P＜0.05）。由-C33T和-C589T構成的IL-4基因單倍型中，未檢測到與哮喘顯著相關的單倍型。通過MDR分析，我們檢測到由IL-4 ? C33T、IL-13 R130Q、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、STAT6 C2892T、CD14-C159T 6

15、個SNPs位點構成的最佳基因交互模型，具有潛在的哮喘發(fā)病風險（OR=4.43，95％ CI 1.30-15.04；P＜0.001，通1000次排列檢驗）。
　　 結論
　　 IL-13基因多態(tài)性單個SNP及其單倍型與中國中部地區(qū)兒童哮喘的易感性相關，提示IL-13在哮喘的發(fā)病中起著重要作用。IL-4Rα基因單倍型與哮喘具有關聯(lián)性，提示IL-4Rα可能以單倍型的形式影響哮喘的易感性。由IL-4 ? C33T、IL-13 R

16、130Q、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、STAT6 C2892T、CD14-C159T構成的基因交互模型可增加中國中部地區(qū)兒童患哮喘的風險性。
　　 第三部分基于家系的IL-4、IL-13、IL-4Rα、STAT6、CD14基因多態(tài)性與支氣管哮喘的易感性研究
　　 目的
　　 基于核心家系資料基礎，探討IL-4-C33T、IL-4-C589T、IL-13 R130Q、IL-13 C1923T、IL

17、-4RαI75V、IL-4RαQ576R、CD14-C159T、STAT6 C2892T各多態(tài)性位點：1）.單個SNP；2）.IL-4、IL-13、IL-4Rα基因單倍型；3）.上述8個SNPs位點之間的基因交互作用與中國中部地區(qū)漢族人群支氣管哮喘及其表型的關系。
　　 方法
　　 采用創(chuàng)造酶切位點－限制性片段長度多態(tài)性（CRS-RFLP）的方法對中國中部地區(qū)126個核心家系（由一名哮喘患者及其雙親組成）共378名成員I

18、L-4-C33T、IL-4-C589T、IL-13 R130Q、IL-13 C1923T、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、CD14-C159T、STAT6 C2892T的多態(tài)性進行分析。采用化學發(fā)光法測定血清總IgE含量。采用基于家系的單倍型相對風險分析（HRR）進行各單個SNP與哮喘的傳遞不平衡關聯(lián)分析。使用FBAT軟件分析單倍型與哮喘之間的關聯(lián)性，及單個SNP、單倍型與哮喘表型血清總IgE的相關性。使用MDR軟件分析上

19、述8個SNPs位點的基因交互作用與哮喘易感性的關系。
　　 結果
　　 經單個SNP與哮喘的HRR分析，各SNP位點與哮喘均無顯著相關性。經FBAT分析，IL-4、IL-13、IL-4Rα各基因單倍型與哮喘均無相關性。IL-13基因C1923T位點T等位基因和R130Q位點A等位基因與哮喘表型血清總IgE水平相關（P=0.038， P=0.043）。其中，C1923T的T等位基因和R130Q的A等位基因均具有較高的血清總

20、IgE水平觀察值，是血清高IgE水平的風險因子。由C1923T和R130Q構成的IL-13基因單倍型CG及由I75V和Q576R構成的IL-4Rα基因單倍型AA與血清總IgE水平相關（P=0.032，P=0.026）。通過MDR分析，我們檢測到由IL-4 ? C33T、IL-13 R130Q、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、STAT6 C2892T、CD14-C159T 6個SNPs位點構成的最佳基因交互模型，具有潛在的哮

21、喘發(fā)病風險（OR=12.08，95％ CI 1.86-78.52；P＜0.001，通1000次排列檢驗）。
　　 結論
　　 IL-13基因多態(tài)性以單個SNP及單倍型形式影響哮喘相關表型血清總IgE的水平。IL-4Rα基因多態(tài)性以單倍型的形式影響血清IgE的水平。由IL-4 ? C33T、IL-13 R130Q、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、STAT6 C2892T、CD14-C159T構成的基因交互作用