五種藥用植物內(nèi)生真菌的分離純化及其次生代謝產(chǎn)物生物活性研究.pdf

1、近些年來(lái)的研究表明，藥用植物內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎的活性次級(jí)代謝物，并且已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新的具有天然活性物質(zhì)的重要來(lái)源。因此，本論文選取五種藥用植物作為材料，對(duì)其內(nèi)生真菌、內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物活性以及化學(xué)成分等方面進(jìn)行研究，研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、運(yùn)用組織塊法，分別從藥用植物荷葉(Nelumbo nucifera)、雷公藤（Tripterygiumwilfordii）、鉤藤（Uncaria tomentosa）、止瀉

2、木（Holarrhena antidysenterica）和大狼毒(Euphorbia nematocypha)的植物組織中分離得到14株、12株、7株、5株、8株，共計(jì)46株內(nèi)生真菌。對(duì)這46株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液和菌絲體進(jìn)行提取，得到了發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物和菌絲體乙醇提取物。
　　2、運(yùn)用酶標(biāo)法，對(duì)內(nèi)生真菌粗提物進(jìn)行抗單胺氧化酶和抗乙酰膽堿酯酶活性的檢測(cè)。抗單胺氧化酶活性顯示，有24種內(nèi)生真菌提取物具有單胺氧化酶抑制活性，在終濃度

3、為167μg/mL下，抑制率在50％以上，其中有8種的抑制率在80％以上，以GT-7發(fā)酵液萃取物的抑酶活性最強(qiáng)，達(dá)92.53％。具有單胺氧化酶抑制活性的樣品分別占各植物內(nèi)生真菌總樣品數(shù)的42.86％、58.33％、42.86％、40％、62.5％?？挂阴Ｄ憠A酯酶活性顯示，有2種內(nèi)生真菌的提取物具有抑制乙酰膽堿酯酶活性，在終濃度為100μ g/mL濃度下，其抑制率在50％以上，其中以ZXM-5發(fā)酵液萃取物的抑酶活性最強(qiáng)，達(dá)61.81％。<

4、br>　　3、運(yùn)用多種現(xiàn)代色譜（硅膠柱色譜法，制備薄層色譜法，凝膠色譜，HPLC等）分離技術(shù)，對(duì)LGT-2、LGT-4、GT-5菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物和LGT-4菌株菌絲體醇提物中的化合物進(jìn)行分離純化，并借助1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS、HMBC、HSQC、1H-1HCOSY、NOESY、MS、IR等手段鑒定了23個(gè)化合物，分別被鑒定為:citrinin（橘青霉素）(1)、4，6，8(14)，22(23)-tetrae

5、n-3-one-ergostane(4，6，8(14)，22(23)-四烯-3-酮-麥角甾烷）(2)、2-Hydroxy-14-tricosenvic acid（2-羥基-14-二十三烯酸）(3)、wortmannin（渥曼青霉素）(4)、wortmannolone(5)、2，4-Dihydroxy-6-((R)-4-hydroxy-2-oxopentyl)-3-Methylbenzaldehyde(6)、(+)-BrefeldinA（

6、布雷菲德菌素A，BFA）(7)、(22E，24R)-Ergosta-5,7,22-trien-3β-ol(8)、 epoxyvirone(9)、 secovironolide(10)、11-desacetoxywortmannin(11)、 ergosta-7,22-dien-3β,5α,6α-triol(cerevisterol)(12)、3-dihydrovirone(13)、11-desacotoxywortmannin(14)、

7、deacetylisowortmin(15)、ergosterol（麥角甾醇）(16)、Campesterol(17)、Phenylalanine（苯丙氨酸）(18)、Physcion（大黃素甲醚）(19)、Chrysophanol（大黃酚）(20)、Rhein（大黃酸）、(21)、ergosterol peroxide（麥角甾醇過(guò)氧化物）(22)、Flufuran(23)。以上化合物中，化合物9、10為新化合物，其中10為virone

8、類呋喃甾體在B環(huán)發(fā)生裂環(huán)重排后得到的一個(gè)新骨架化合物。
　　4、對(duì)分離出來(lái)的23個(gè)化合物進(jìn)行抗單胺氧化酶和抗乙酰膽堿酯酶活性檢測(cè)，結(jié)果表明，化合物4、10、23顯示了中等強(qiáng)度的單胺氧化酶抑制活性，在終濃度167μg/mL時(shí)其抑制率分別為78.40％、83.55％、88.67％，其IC50值分別為91.22μg/mL、40.17μg/mL、29.19μg/mL?；衔?顯示了中等強(qiáng)度的乙酰膽堿酯酶抑制活性，在終濃度167μg/mL時(shí)

9、其抑制率為56.37％，IC50值為147.74μg/mL。
　　5、運(yùn)用分子生物學(xué)手段，對(duì)菌株LGT-2、LGT-4和菌株GT-5的ITS區(qū)序列分析，在Blast上與其同源性較高的ITS rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)聚類分析，并結(jié)合菌落形態(tài)顏色及菌絲體、分生孢子梗的觀察，鑒定菌株LGT-2和GT-5均為曲霉屬(Aspergillussp.)真菌，菌株LGT-4為裸節(jié)菌屬（Talaromyces sp.）真菌。將菌株ITS序列提交到