人參內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指那些在其生活史中某一段時(shí)期生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌，包括營表生的腐生真菌和對宿主暫時(shí)沒有傷害的潛伏性病原真菌和菌根菌。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生新的天然產(chǎn)物，甚至可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的代謝產(chǎn)物，因而成為天然產(chǎn)物的重要來源。 本課題對具有重要價(jià)值的藥用植物人參Panax ginseng CA.Meyer中的內(nèi)生真菌進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。通

2、過對5年生園參和15年生移山參進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離，總共分離純化了內(nèi)生真菌48株(isolates)，其中園參內(nèi)生真菌27株，移山參內(nèi)生真菌21株；并通過形態(tài)及分子生物學(xué)方法鑒定了其中40株，鑒定到14個(gè)分類單元，將其歸屬到8科(Mortierellaceae，Hypocreaceae，Nectriaceae，Mucorales，Mucoraceae，Trichocomaceae，Leptosphaeriaceae，Pleosporace

3、ae)，10屬12種(Mortierella monospora，Trichoderma hamatum，Nectria haematococca，Umbelopsis ramanniana，Mucorcircinelloides，Penicillium melinii，Talaromyces intermedius，Aspergillus versicolor，Aspergillus nidulans，Penicillium oxal

4、icum，Penicillium sp.，Penicillium polonicum，Leptosphaeria sp.1，Alternaria mali)，其中，Trichoderma hamatum為園參內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種，分離概率達(dá)23％，Nectria haematococca為移山參內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種，分離概率達(dá)19％。 本課題研究過程中，將內(nèi)生真菌的發(fā)酵液在紫外吸收波長203 nm(2005版藥典中人參皂苷的檢測波長)進(jìn)

5、行HPLC檢測，發(fā)現(xiàn)其中23株真菌的產(chǎn)物顯示與人參皂苷類化合物的色譜保留時(shí)間及峰型較為一致，因此對其分別進(jìn)行了LC-MS檢測，經(jīng)選擇性離子檢測(SIM)，其中12株內(nèi)生真菌與人參皂苷色譜行為較一致，對這12株菌株進(jìn)行大量發(fā)酵、濃縮，分別進(jìn)行質(zhì)譜全掃描(SCAN)，最終發(fā)現(xiàn)待測樣品與目標(biāo)化合物分子量不一致。經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)，未能發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生人參皂苷的內(nèi)生真菌。 以稻瘟霉(Pyricularia oryzae P-2b)為篩選模型，初步

6、篩選內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物活性，共計(jì)48株人參內(nèi)生真菌中具有完全抑制稻瘟霉活性的菌株占33.3％(16株)。進(jìn)一步體外抗真菌、抗腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，11株(22.9％)內(nèi)生真菌產(chǎn)物的抗白色念珠菌(Candida albicans)、新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)、紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)、薰煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)活性較好，5株(10.4％)內(nèi)生真菌產(chǎn)物的抗胃癌細(xì)

7、胞(MKN45)、腸癌細(xì)胞(LOVO)、肝癌細(xì)胞(HepG2)、白血病細(xì)胞(HL-60)活性較好。其中，以菌株Yuan-25(Penicillium melinii)抗真菌活性與菌株Yuan-27(Mortierella monospora)抗腫瘤活性最為顯著。 菌株Yuan-25(Penicillium melinii)的抗真菌、抗腫瘤活性均較顯著，并且形態(tài)特別、具有特殊氣味，故對其內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物和宿主園參進(jìn)行乙醚部位的GC

8、-MS檢測。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者有共同化合物-人參炔醇(falcarinol，panaxynol)，一種抗腫瘤活性物質(zhì)。此外，Yuan-25(Penicillium melinii)的乙醚部位還存在一些生物活性物質(zhì)，如蒼耳素(xanthatin)，異丹參酮Ⅱ(isotanshinoneⅡ)等。 從以活性篩選為導(dǎo)向得到的活性菌株中，選擇了生物活性顯著、產(chǎn)量高、相對穩(wěn)定的5株：Yuan-13(Penicillium sp.)、Yuan-25

9、(Penicillium melinii)、Yuan-27(Mortierellamonospora)、Yuan-30、YSS-13(Alternaria mali)，進(jìn)行化學(xué)成分研究；同時(shí)對抗腫瘤活性化合物的作用機(jī)理進(jìn)行初步探討。以抗稻瘟霉活性為指導(dǎo)，利用現(xiàn)代色譜方法和波譜學(xué)技術(shù)，已從人參內(nèi)生真菌的活性部位-乙酸乙酯相，分離并鑒定出了9個(gè)化合物，分別命名為：(1)人參菌素(2，4-二羥基-3-甲基-6-[(Z)-(6-甲基-5，6-二

10、氫-2H-吡喃-2-亞基)甲基]-苯甲醛)；(2)藍(lán)菌素(Brefeldin A)；(3)2，4，5-三甲基-1，3-苯二酚；(4)2，4-二羥基-3，5，6-三甲基苯甲酸甲酯；(5)甘露醇(mannitol)；(6)3-異丙烯基-(Z)-丁烯二酸單甲酯；(7)麥角甾醇(ergosterol)；(8)過氧麥角甾醇(ergosterolperoxide)；(9)對羥乙基苯酚(tyrosol)。其中，人參菌素為未報(bào)道過的新化合物，而藍(lán)菌素為

11、具有重要科研及經(jīng)濟(jì)價(jià)值的化合物，兩者均表現(xiàn)出較好的生物活性，具有重要的研究開發(fā)價(jià)值。本研究分離得到的內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物均與人參中已報(bào)道的成分不同。 通過以上研究，得到一些有意義的結(jié)果，主要包括：(1)從人參中分離得到48株內(nèi)生真菌，對部分菌株進(jìn)行了鑒定，并且篩選出了若干生物活性較好的菌株(Yuan-25、Yuan-27、Yuan-30、Yuan-31、YSS-13等)，表明人參內(nèi)生真菌物種多樣性豐富，是龐大的微生物資源庫；(2

12、)菌株Yuan-25(Penicillium melinii)的乙醚部位生物活性較好，具有豐富的化學(xué)成分，并能產(chǎn)生與宿主相同的成分-人參炔醇(falcarinol，panaxynol)；(3)分離獲得5株生物活性較強(qiáng)、產(chǎn)量較高、相對穩(wěn)定的內(nèi)生真菌，通過柱層析對這5株內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到單體化合物14種，最終鑒定出9種化合物，均與人參中已報(bào)道的成分不同；(4)Yuan-25-1為新化合物，且活性較顯著，進(jìn)一步表明內(nèi)生真菌是