人參內生真菌及其次生代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、內生真菌(endophytic fungi)是指那些在其生活史中某一段時期生活在植物組織內，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌，包括營表生的腐生真菌和對宿主暫時沒有傷害的潛伏性病原真菌和菌根菌。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植物內生真菌能產(chǎn)生新的天然產(chǎn)物，甚至可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的代謝產(chǎn)物，因而成為天然產(chǎn)物的重要來源。 本課題對具有重要價值的藥用植物人參Panax ginseng CA.Meyer中的內生真菌進行了較系統(tǒng)的研究。通

2、過對5年生園參和15年生移山參進行內生真菌的分離，總共分離純化了內生真菌48株(isolates)，其中園參內生真菌27株，移山參內生真菌21株；并通過形態(tài)及分子生物學方法鑒定了其中40株，鑒定到14個分類單元，將其歸屬到8科(Mortierellaceae，Hypocreaceae，Nectriaceae，Mucorales，Mucoraceae，Trichocomaceae，Leptosphaeriaceae，Pleosporace

3、ae)，10屬12種(Mortierella monospora，Trichoderma hamatum，Nectria haematococca，Umbelopsis ramanniana，Mucorcircinelloides，Penicillium melinii，Talaromyces intermedius，Aspergillus versicolor，Aspergillus nidulans，Penicillium oxal

4、icum，Penicillium sp.，Penicillium polonicum，Leptosphaeria sp.1，Alternaria mali)，其中，Trichoderma hamatum為園參內生真菌的優(yōu)勢種，分離概率達23％，Nectria haematococca為移山參內生真菌的優(yōu)勢種，分離概率達19％。 本課題研究過程中，將內生真菌的發(fā)酵液在紫外吸收波長203 nm(2005版藥典中人參皂苷的檢測波長)進

5、行HPLC檢測，發(fā)現(xiàn)其中23株真菌的產(chǎn)物顯示與人參皂苷類化合物的色譜保留時間及峰型較為一致，因此對其分別進行了LC-MS檢測，經(jīng)選擇性離子檢測(SIM)，其中12株內生真菌與人參皂苷色譜行為較一致，對這12株菌株進行大量發(fā)酵、濃縮，分別進行質譜全掃描(SCAN)，最終發(fā)現(xiàn)待測樣品與目標化合物分子量不一致。經(jīng)過上述實驗，未能發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生人參皂苷的內生真菌。 以稻瘟霉(Pyricularia oryzae P-2b)為篩選模型，初步

6、篩選內生真菌發(fā)酵產(chǎn)物活性，共計48株人參內生真菌中具有完全抑制稻瘟霉活性的菌株占33.3％(16株)。進一步體外抗真菌、抗腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，11株(22.9％)內生真菌產(chǎn)物的抗白色念珠菌(Candida albicans)、新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)、紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)、薰煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)活性較好，5株(10.4％)內生真菌產(chǎn)物的抗胃癌細

7、胞(MKN45)、腸癌細胞(LOVO)、肝癌細胞(HepG2)、白血病細胞(HL-60)活性較好。其中，以菌株Yuan-25(Penicillium melinii)抗真菌活性與菌株Yuan-27(Mortierella monospora)抗腫瘤活性最為顯著。 菌株Yuan-25(Penicillium melinii)的抗真菌、抗腫瘤活性均較顯著，并且形態(tài)特別、具有特殊氣味，故對其內生真菌發(fā)酵產(chǎn)物和宿主園參進行乙醚部位的GC

8、-MS檢測。實驗發(fā)現(xiàn)兩者有共同化合物-人參炔醇(falcarinol，panaxynol)，一種抗腫瘤活性物質。此外，Yuan-25(Penicillium melinii)的乙醚部位還存在一些生物活性物質，如蒼耳素(xanthatin)，異丹參酮Ⅱ(isotanshinoneⅡ)等。 從以活性篩選為導向得到的活性菌株中，選擇了生物活性顯著、產(chǎn)量高、相對穩(wěn)定的5株：Yuan-13(Penicillium sp.)、Yuan-25

9、(Penicillium melinii)、Yuan-27(Mortierellamonospora)、Yuan-30、YSS-13(Alternaria mali)，進行化學成分研究；同時對抗腫瘤活性化合物的作用機理進行初步探討。以抗稻瘟霉活性為指導，利用現(xiàn)代色譜方法和波譜學技術，已從人參內生真菌的活性部位-乙酸乙酯相，分離并鑒定出了9個化合物，分別命名為：(1)人參菌素(2，4-二羥基-3-甲基-6-[(Z)-(6-甲基-5，6-二

10、氫-2H-吡喃-2-亞基)甲基]-苯甲醛)；(2)藍菌素(Brefeldin A)；(3)2，4，5-三甲基-1，3-苯二酚；(4)2，4-二羥基-3，5，6-三甲基苯甲酸甲酯；(5)甘露醇(mannitol)；(6)3-異丙烯基-(Z)-丁烯二酸單甲酯；(7)麥角甾醇(ergosterol)；(8)過氧麥角甾醇(ergosterolperoxide)；(9)對羥乙基苯酚(tyrosol)。其中，人參菌素為未報道過的新化合物，而藍菌素為

11、具有重要科研及經(jīng)濟價值的化合物，兩者均表現(xiàn)出較好的生物活性，具有重要的研究開發(fā)價值。本研究分離得到的內生真菌次生代謝產(chǎn)物均與人參中已報道的成分不同。 通過以上研究，得到一些有意義的結果，主要包括：(1)從人參中分離得到48株內生真菌，對部分菌株進行了鑒定，并且篩選出了若干生物活性較好的菌株(Yuan-25、Yuan-27、Yuan-30、Yuan-31、YSS-13等)，表明人參內生真菌物種多樣性豐富，是龐大的微生物資源庫；(2

12、)菌株Yuan-25(Penicillium melinii)的乙醚部位生物活性較好，具有豐富的化學成分，并能產(chǎn)生與宿主相同的成分-人參炔醇(falcarinol，panaxynol)；(3)分離獲得5株生物活性較強、產(chǎn)量較高、相對穩(wěn)定的內生真菌，通過柱層析對這5株內生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物進行分離純化，得到單體化合物14種，最終鑒定出9種化合物，均與人參中已報道的成分不同；(4)Yuan-25-1為新化合物，且活性較顯著，進一步表明內生真菌是